DTT et WesternBlot

[invitec45abc54]

Bonjour à tous,
une petite question aux pro du western blot...

Au labo, un DR encadrant une stagiaire dans la caractérisation et la définition du rôle d'une enzyme (SSAO) au cours des processus inflammatoire articulaires, lui a demandé de faire des WesternBlot à partir d'extraits protéiques tissulaires.

WesternBlot on ne peut pas plus classique : dénaturation des protéines 10min à 95°C dans du tampon de Laemli (contenant donc du SDS...). Bien sûr SDS-PAGE pour la migration... Donc en conditions dénaturantes...

La bande attendue devait être à 97kDa.. Elle y était bien, mais voilà, une bande aux alentours de 300kDa est apparue. Le DR a conclu à un trimère, voulant faire la découverte du siècle (dans le domaine bien sûr). Il a alors demandé à sa stagiaire d'incuber dans des solutions de DTT ses extraits protéiques avant de lancer ses WesternBlot comme décrits ci dessus...

Je vous laisse me dire ce que vous en pensez...

(Sérieux, si vous avez des explications à ça, donnez les moi car maintenant on doit justifier cette manip dans un rapport/soutenance...)

Bien à vous tous,

Marc.
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[invite71f23525]

Bonsoir,

Un trimère se forme le plus souvent grâce à une conformation tridimensionnelle particulière à l'interface entre les différents partenaires. La perte de cette conformation spatiale par dénaturation peut provoquer une perte de la trimérisation. Toutefois il y a différents degrés de dénaturation. Par exemple, la chaleur seule en présence de SDS induit une perte de la conformation 3D de la protéine sauf aux endroits où on a des ponts disulfures qui eux maintiennent la structure 3D par liaison covalente, impossible à rompre avec chaleur + SDS. Si on a des ponts disulfures au niveau de l'interface de trimérisation, il est probable que chaleur + SDS ne suffise pas à dissocier le trimère. Pour cette raison, le DR envisage d'incuber ses extraits protéiques avec du DTT pour rompre les ponts disulfures qui conserverait son trimère dans son état "natif".

Le résultat peut être le maintien de la présence de la bande à 300 kDa ou pas. Si elle est toujours présente, cela veut dire soit que la formation de son trimère n'est pas dépendante d'un maintien de la structure 3D de l'interface de trimérisation par des ponts disulfures, soit que la bande à 300 kDa est une protéine ou un complexe qui n'a rien à voir avec sa protéine d'intérêt (bande non spécifique). Si elle n'est plus présente, cela veut dire que son hypothèse était bonne, c'est à dire que le trimère est maintenu grâce à des ponts disulfures stabilisant la structure 3D.

Cette méthode n'est valable que si l'une des protéines formant le trimère (dans le cas d'un hétérotrimère), passe par le RE pour sa synthèse. En effet, il n'y a presque que dans le RE que la formation de ponts disulfures, qui est oxydante, peut se faire. Le cytosol est fortement défavorable à la formation spontanée de ponts disulfures à cause de l'environnement réducteur, et l'enzyme catalysant les ponts disulfures se trouve dans le RE.

[invitec45abc54]

Salut LXR,

je suis entièrment d'acord avec toi, mais j'ai toujours un doute...
Le SDS ne réduit pas les ponts S-S, nous sommes d'accord, mais le Laemmli contient du B2-mercaptoethanol dont le rôle est justement de réduire les ponts disulfure.
Alors je me demande vraiment si les étapes de préincubation au DTT étaient nécessaires, pour des protéines de rats je sous-entends (Pour des protéines d'organismes thermophiles par exemple ou autre organisme extrème on aurait pu se poser la QS de savoir si le bleu de Laemmli utilisé couramment induit des conditions de dénaturation suffisantes...).

Tu en penses quoi ?

Bien à vous tous
Marc

[invite71f23525]

Dans les labos, on peut préparer le Laemli sans b-mercapto ni DTT, mais en les ajoutant juste avant la dénaturation (question de stabilité de ces molécules qui s'oxydent facilement). Je suppose que lors de l'observation du complexe de 300 kDa, leur dénaturation était faite sans réducteur de ponts disulfures.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec45abc54]

Et bien non, justement..
La dénaturation avait bien été faite dans du bleu contenant bien du B-ME...
Donc en fait ma vrai question est :

es-tu d'accord avec moi que ca ne servait à rien de préincuber au DTT si le laemmli contenait bien du B-ME..?