Immunoblotting, anticorps

[invite41c36b9a]

Salut !

Je bosse sur un article de biochimie sur le rôle des cystéines dans une enzyme, et pour vérifier certaines choses, les auteurs ont fait une analyse par immunoblotting.

Ma question porte sur les anticorps qu'ils ont utilisés.... Au lieu de prendre un anticorps contre tout l'enzyme (anticorps qui existe), ils ont préféré d'abord ajouter - par clonage - une séquence tag et ensuite utiliser un anticorps contre ce tag...

Auriez-vous des idées de la raison qui fait qu'ils ont préféré cette solution à l'anticorps spécifique ?


Indications :
Différence de prix significative ?
-anticorps contre enzyme : 320 $/100 ml
-anticorps contre séquence tag : 320$/200ml

- Les deux anticorps sont polyclonaux

- L'anticorps contre tag provoque une baisse de l'activité enzymatique


Si vous avez des idées, merci beaucoup !!!
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[Flyingbike]

peut être que l'anticorps n'est pas ou peu spécifique. Au moins avec un tag il n'y a plus ce problème. Tu as la ref de l'article ?

[invite41c36b9a]

La référence c'est :

"Role of cysteine residues in thiol modification of Acyl-CoA: Diacylglycerol acyltransferase 2 from yeast" de Qin Liu & all

On peut savoir si l'anticorps est bien spécifique... ?

Merci en tous cas de ta réponse !

[Flyingbike]

Bon, alors je n'ai pas le temps de le lire en entier, mais ce n'est pas pour vérifier l'expression spécifique de la constuction et différencier ainsi d'une protéine endogène ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite41c36b9a]

Je ne sais pas exactement ce que tu entends par expression spécifique de la construction...

En résumé de l'article : on sait que c'est une protéine transmembranaire, on a sa séquence donc on sait aussi qu'il y a 7 cystéines. Comme souvent dans les enzymes les cystéines ont un rôle important, le but de l'article est de le vérifier dans cette enzyme en particulier. Ainsi, ils font plusieurs expérience sur l'activité enzymatique, pour arriver aux conclusions qu'il n'y a pas de ponts disulfides et que finalement si on les mute en alanine il n'y a pas de baisse de l'activité enzymatique et si on ajoute des agents chimiques modifiant les thiols, alors une seule cystéine provoque une baisse de l'activité (donc supposition que cette cystéine est proche du site de liaison au substrat, et qu'il y a encombrement stérique quand agent chimique NEM est lié à cette cystéine)

l'immunoblotting est juste une des techniques utilisées pour arriver à ces conclusions (par visualisation de l'intensité sur SDS PAGE ), donc à priori je ne vois pas le lien avec une protéine endogène ...
Je ne sais pas si mes indications t'aident... ?

[Flyingbike]

la protéine existe bien chez la levure sauvage ? si oui, pour vérifier que la construction de la protéine mutée ou sauvage s'exprime bien, il faut pouvoir la différencier de celle que la levure produit naturellement.

[invite41c36b9a]

Oui la protéine existe dans les levures sauvages (après on utilise S cerevisiae)
donc l ajout de tag servirait à la différencier?

[Flyingbike]

ben oui, l'anticorps spécifique reconnaitrait les deux, alors que l'anti tag ne reconnait que la recombinante. Comme ca tu es sur que ta construction s'exprime, et tu peux en plus purifier ta protéine en utilisant ce tag (d'ailleurs c'est peut être ce qui a été fait non ?)

[invite41c36b9a]

Oui, parfait comme explication, merci beaucoup !!!

Je peux te poser une autre question ? Ou j abuse trop...?

parce que dans l article ils trouvent finalement qu une des cysteines se trouve proche du site actif (par déduction car quand un groupe se lie au thiol il y a baisse de l activité enzymatique sûrement par obstruction stérique...)
d' ou ma question : connais tu une technique pour vérifier que la cysteine est bien proche du site actif, sachant qu on connait La séquence de la protéine mais pas sa structure 3D ?

En tous cas merci pour ton aide! Elle m a déjà été très utile!

[Flyingbike]

OUh, pas évident... quand on n'a pas la structure 3D, on peut fonctionner par analogie avec des protéines déjà caractérisées. Sinon je ne vois pas...