Besoin d'un protocole

[invite9951eeb1]

Bonjour à tous,

Je travaille sur la biodiversité des frênes. On veut extraire l'ADN du fruit (samara en anglais) mais on ne trouve pas de protocole efficace. Quelqu'un pourrait il m'aider et me faire parvenir des idées ??
MErci de votre aide;
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[invite94612525]

Bonjour Bubllefish,

Etant donne que l’AND est sense etre le meme dans tous les tissuss, on choisi en general les tissues qui donne le meilleur rendement, c’est a dire les fleurs ou les meristemes (petites cellules) plutot que les fruit. Quoi qu’il en soit, voici un protocole qui marche bien chez plusieurs plantes (je l’ai teste sur fleurs et feuilles). L’aADN obetenu est de qualite Southern-blot ou PCR.

Les échantillons (1 à 2 inflorescences) sont broyés en présence de 600 l de tampon
SDS/protéinase K (0,1M Tris-HCL, pH 8,2, 50 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 2 % SDS, 0,1 mg/ml
protéinase K). Ils incubent 10 minutes à 37°C puis 500 l de phénol-chloroforme-isoamylalcool
(25 : 24 : 1) équilibré avec du TE (Tris-EDTA) 0,1 M NaCl est ajouté. Les échantillons sont
ensuite homogénéisés 5 minutes à 37°C puis centrifugés 5 minutes à 10000 g. Le surnageant est
alors prélevé et 50 l d’acétate de sodium 3 M pH 5,2 et 500 l d’isopropanol lui sont ajoutés.
Après agitation, puis centrifugation (1 min, 10000 g), le culot est resuspendu dans 500 l d'eau
auxquels sont ajoutés 50 l d’acétate de sodium 3M et 500 l d’éthanol 100 %. Après
homogénisation et centrifugation (1 min, 10000 g), les culots sont séchés et repris dans 50 l de
TE.

NB le carre c'est pour micro

Le broyage est tres important, une poudre fine peut etre obtenue en broyant dans un mortier dans l’azote liquide avant de melanger au tempon

En cas de probleme savec des polysaccharrides, je suggere d’essayer aussi ce protocole qui marche avec encore plus de plantes differentes :
http://www2.unil.ch/lpc/docs/pdf/PPprotocols2001.pdf

.
Noun

PS : phenol et chloroforme => sous hotte

[invite6e00ad7f]

Salut,

voici un protocole qui marche bien chez plusieurs plantes

C'est vrai, j'utilise à peu près le même protocole pour extraire l'ADN des myceliums de champignons, à quelques détails près.

C'est vrai qu'il y a aussi le phénol-chloroforme, mais cette technique est beaucoup moins pratique.

@+

[invite9951eeb1]

Merci pour ces renseignements, je vais tenter cela et je vous tiendrai au courant.
Je sais bien aussi qu'il serait plus facile de travailler depuis des feuilles mais malheureusement ce n'est pas moi qui decide. Apparement pour les etudes de biodiversite genetique c'est mieux car dans les samaras il y a le patrimoine maternel.
Merci encore !

Have a nice day

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9951eeb1]

Re...

Juste pour tenir informés que en fait, le CTAB protocole est bien adapté pour extraire l'ADN végétal (ici des frênes) mais que pour du matériel mort, il faut juste laisser une longue phase isopropanol. En fait au lieu de tout de suite centrifuguer l'isopropanol; laissez vos échantillons au frigo au moins 12h et reprennez le protocole le lendemain. Ca marche très bien...

Voilà !
A bientot