Phage display

[Edelweiss68]

Bonjour,

Comment est induite l'expression du fragment Fab (ou autre fragment d'anticorps) à la surface du phage?

Plus précisément, je sais que l'on transfecte les bactéries par un phagemide puis qu'elles sont co-infectées par un phage helper. Il y a aussi le gène lacZ qui entre en jeu mais son rôle n'est pas de vérifier que le phagemide a bien été intégré au génome du phage.

Donc pour induire cette expression de la protéine recombinante fusionnée avec la protéine de surface pIII ou pVIII du phage, est-ce que l'on ajoute de l'IPTG? Ou suffit-il de cultiver les bactéries dans un milieu en absence de glucose? Ou autrement?

Merci...
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[invite02e16773]

Salut,

Dans mon cas (j'utilise la banque de scFv Tolimson I+J) abaisser la concentration en glucose après infection par le helper suffit : je passe de 1% à 0,1%.
Par contre, lorsque je veux exprimer les anticorps solubles j'ajoute en plus de l'IPTG (1mM).

[Edelweiss68]

OK je pense que c'était pareil pour moi alors, j'ai pas souvenir d'avoir ajouter de l'IPTG. Par contre comment passes tu de 1% à 0,1%? Tu changes de milieu?

Moi j'avais utilisé un mélange des milieux SOB et SOC.

Merci!

[invite02e16773]

De rien !

Oui je change de milieu et j'incube toute la nuit à 28-30°C.
C'est également dans ce nouveau milieu que se fait la sélection pour la transfection du helper.

C'est quoi les milieux SOB et SOC ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Edelweiss68]

Ils sont utilisés pour la préparation de bactéries électrocompétentes et après la transformation des bactéries électroporées.

Pour SOB, il y a de la tryptone, extrait de levure, NaCl, sulfate de magnesium, chlorure de K. Et pour SOC, c'est du SOB supplémenté en glucose 20%.

[invite02e16773]

Ah ok. Je n'ai pas eu à réaliser ces étapes, puisque j'avais déjà des bactéries transfectées (et pré-sélectionnées) lors de mon arrivée au labo.

Merci bien

[Edelweiss68]

J'espère que je ne t'ai pas dit de bêtises...

Du coup, quel milieu utilises-tu pour la production des phages recombinants?

[invite02e16773]

Mon milieu minimum, c'est du TY 2x (extraits de levure, tryptone et chlorure de sodium)

Tous les phagemides de la banque ont un gène se résistance à l'ampicilline, le phage helper un gène de resistance à la kanamycine.
Donc pour la production de phages recombinants : 2xTY + ampicilline (100ug/mL) + kanamycine (50ug/mL) + 0,1% glucose.
Et pour la transfection des helper : 2xTY + ampicilline + 1% glucose.

Les protocoles que j'utilise (E.b, D et F) sont ici : http://www.geneservice.co.uk/product...omlinsonIJ.pdf

[Edelweiss68]

OK merci!