Casser des aggrégats

[Enialix]

Bonjour à tous,

Je travail sur des cellules eucaryotes, après avoir fait une extraction protéique, j'ai dénaturé certains de mes échantillons à 95°C, le souci est que j'ai inversé les tubes et la protéine que je veux voir forme des aggrégats lorsqu'on la dénature à 95°C.

Les échantillons sont dans du tampon de Laemmli.

Est-il possible de casser ces aggrégats sans casser ma protéine? Car ayant déjà fait l'expérience, il est impossibe d'avoir un bon signal en western blot avec cette protéine aggrégée.

Merci de votre aide.
-----

[Enialix]

Et bien je croix que mes échantillons sont perdu ^^.

Personne ne sait?

[invite71f23525]

Bonjour,

Tu dis que la protéine que tu veux voir forme des aggrégats mais cela dans des extraits cellulaires. A moins que des aggrégats ne se forment que dans des extraits de cellules surexprimant ta protéine et pas dans des extraits ne la surexprimant pas, tu ne peux pas dire que ces aggrégats sont ta protéine.

Sur quelles cellules travailles-tu? Quelle méthode de lyse utilises-tu? Es-tu sûr que des aggrégats ne sont pas déjà présents avant de dénaturer? Enfin, qu'appelles-tu des aggrégats, ce sont des particules plutôt solides et granuleuses ou c'est un amas visqueux qui bouche la pipette?

[Enialix]

Mes cellules surexpriment en effet ma protéine, je travaille sur des cellules BHK et j'utilise le tampon RIPA comme tampon de lyse.

D'habitude, une fois le tampon de Laemmli ajouté, je dénature 1h à T° ambiante pour cette protéine. Et les résultats en western sont très satisfaisants, une belle bande.
Par contre, si je dénature à 95°C, cela me donne en western un paté à une taille supérieure à la taille habituelle, je pense donc que ces aggrégats ne sont pas présents à la base.

Je ne vois pas ces aggrégats, je sais qu'ils sont là uniquement grâce au western blot, j'avais déja fais l'erreur de charger sur un gel les échantillons dénaturés à 95°C, mais là je me suis rendu compte de l'inversion de tube avant.
C'est pour cela que je pense que si je charge mes échantillons, cela me donnera un paté, et que je voudrais casser ces petits aggrégats, pour pouvoir charger mon gel.

Merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite71f23525]

OK.

En effet, la chaleur induit fréquemment la formation d'aggrégats pour les protéines surexprimées. Je pensais que ces aggrégats étaient visibles dans ton extrait cellulaire mais d'après ce que tu me dis tu les retrouves plutôt sur ton western donc ce n'est pas l'ADN.

Tu peux essayer 10 minutes à 65°C mais si ta dénaturation d'une heure à température ambiante marche bien, pourquoi la changer? Maintenant que tes aggrégats sont formés, tu peux recommencer car je n'ai jamais entendu parler d'une méthode permettant de les dissocier. Tu peux peut-être diluer tes extraits cellulaires et bien vortexer en chauffant modérément (65°C). Ca marche avec les aggrégats d'ADN donc peut-être ça marchera avec les aggrégats protéiques, sans garantie.

[Enialix]

Bonjour,

Merci de ta réponse, en vortexant j'ai peur de casser ma protéine qui est assez grosse.
J'ai changé ma dénaturation car on m'a dit que c'était préférable pour les autres protéines de dénaturer à 95°C, mais m'étant trompé de tube, j'ai mis à 95°C ma protéine surexprimée, erreur de ma part ^^.

Par contre on m'a dit aujourd'hui que je pouvais tenter avec de l'urée, mais je ne sais pas à quelle concentration ni combien de temps et à quelle température, quelqu'un a-t-il déjà fait cela?

Encore merci.

[gorben]

Salut,

Perso je tenterais pas l'uree mais plutot Guanidine (entre 3 et 6M) ou TFE (2,2,2-Trifluoroethanol, ~ 10%). L'uree c'est 8M en general.

Je ne sais pas comment va migrer ton gel avec 6M de guanidine ou 10% de TFE, mais au pire une fois qu'elle est soluble tu peux faire une precipitation TCA ou Acetone.

A+