gros besoin d'aide: toutes mes cellules C2C12 sont mortes!

[invited07ac121]

Bonjour à tous,

Je viens de redémarrer un labo de culture cellulaire, et lundi, j'ai ensemencé mes premières cellules pour amplification.
Aujourd'hui, tout est crevé. Je panique complètement, j'ai été embauchée pour redémarrer le labo, et je suis toute seule à faire de la culture!
voilà ce que j'ai fait:

- mes cellules sont des C2C12 (myoblastes de souris). c'est une ampoule commerciale.
- mon milieu est du DMEM + Glutamax, dans lequel j'ai rajouté du pyruvate sodium, des acides aminés non essentiels, penicilline-streptomycine, fungizone, et 10% de SVF. (compo en pièce jointe)
- Lors de ma décongélation, j'ai fait un test au bleu Trypan, aucune cellule bleue.
- J'ai ensemencé 6 flasks 175 cm² avec 450 000 cellules, et 2 flasks avec 900 000 cellules, dans lesquels j'ai mis 60ml de milieu.
- j'ai incubé à 37°C - 5% de CO2 en prenant soin d'ouvrir mes bouchon de flasks d'1/3 de tour, et j'ai changé de milieu au bout de 24h (mardi). Tout était ok.
- mercredi (hier), j'ai jeté un oeil, et elles commençaient à s'arrondir, et j'avais quelques débris cellulaires.
- aujourd'hui, je n'ai quasiment que des débris cellulaires

S'il vous plait, aidez moi! Je dois passer à côté de quelque chose, mais je ne vois pas quoi!

Mes pipettes sont vieilles, est-ce qu'elles peuvent être périmées et relarguer des choses?
Mon incubateur ne descend pas en dessous de 5.8% de CO2 mais je doute que ce soit ça.

Je suis en grosse grosse panique.
Merci de votre aide.
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[Flyingbike]

Ta densité de plating me parait extrêmement faible. C'est normal ? SInon pour les pipettes je ne commencerais pas a chercher par là...

[invited07ac121]

oui moi aussi ça me paraissait faible, mais dans la "notice" envoyée avec mes cellules, il est marqué de les ensemencer à 2000 cellules/cm². soit 2000x175cm² = 350 000 cellules / flask (moi je suis à 2500 cellules/cm², et j'ai justement fait deux flasks à 5000 C/cm² parce que ça me paraissait faible).
Pour les pipettes, je sais bien, j'essaie de me raccrocher à ce que je peux!

[invited07ac121]

Une copine me dit qu'elle ne met que 25 ml de milieu dans ses flasks 162cm².
Est-ce que ça peut venir de là, et que je n'ai pas assez d'échanges gazeux?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

je ne sais pas, mais a mon avis 60mL c'est beaucoup. 25 c'est normal.

[invited07ac121]

Ben j'ai pas fait de culture depuis longtemps, et du coup je ne me souvenais plus des volumes, et j'ai trouvé ça là: http://www.protocol-online.org/forum...showtopic=6418
Tu penses que ça pourrait venir de là?

[LXR]

Attention pour le lien que tu donnes, je trouve les volumes très importants par rapport à la taille des flasks. Je pense qu'il s'agit là de culture de cellules non adhérente, où les flasks sont cultivés en position verticale et où le volume de milieu est nettement plus important que la culture horizontale de cellules adhérentes.

Plusieurs questions :

- Quand as-tu effectué le test bleu trypan : sur des cellules provenant directement de l'ampoule congelée, ou sur les cellules qui ont adhéré après la décongélation?

- Combien de temps as-tu attendu entre l'adhésion des premières cellules et les grosses cultures peu denses (les 6 flasks à 450000,...)?


Une remarque : sur des cellules décongelées depuis peu, il faut éviter de changer le milieu trop fréquemment, à moins que ce soit une lignée où c'est conseillé. En effet les cellules sécrètent des facteurs de croissance qui s'enrichissent dans le milieu de culture. Si tu le change trop souvent, elles ne bénéficient pas de ces facteurs et cela se ressent sur leur prolifération, ou sur leur survie.

[invited07ac121]

Attention pour le lien que tu donnes, je trouve les volumes très importants par rapport à la taille des flasks. Je pense qu'il s'agit là de culture de cellules non adhérente, où les flasks sont cultivés en position verticale et où le volume de milieu est nettement plus important que la culture horizontale de cellules adhérentes.

Plusieurs questions :

- Quand as-tu effectué le test bleu trypan : sur des cellules provenant directement de l'ampoule congelée, ou sur les cellules qui ont adhéré après la décongélation?

- Combien de temps as-tu attendu entre l'adhésion des premières cellules et les grosses cultures peu denses (les 6 flasks à 450000,...)?


Une remarque : sur des cellules décongelées depuis peu, il faut éviter de changer le milieu trop fréquemment, à moins que ce soit une lignée où c'est conseillé. En effet les cellules sécrètent des facteurs de croissance qui s'enrichissent dans le milieu de culture. Si tu le change trop souvent, elles ne bénéficient pas de ces facteurs et cela se ressent sur leur prolifération, ou sur leur survie.

Merci de ton aide!

- Bon déjà, je vais refaire une culture avec une vieille ampoule, en ne mettant que 25 ml de milieu. Mais ça peut vraiment venir de là?

- Ensuite, j'ai décongelé mon ampoule que j'ai reprise dans 10 ml de milieu, et c'est sur cette suspension que j'ai fait mon test de viabilité. Donc avant même d'ensemencer mes cellules.

- Ensuite, pour ce qui est de le densité d'ensemencement, c'est depuis mon ampoule de départ que j'ai fait mes flasks à 450 000 cellules. Si ça vient de la trop faible densité d'ensemencement, je ne comprends pas, sur ma cell line data sheet, il est marqué de les cultiver à 1-2 000 cell/cm²! Vous me conseillez quelle densité du coup?

- mon premier changement de milieu a été fait 24h après l'ensemencement. On m'a toujours dit qu'il fallait le changer à 24h pour éliminer le cryoprotecteur une fois qu'elles ont adhéré? Et ensuite, je change mon milieu tous les 2 à 3 jours.

ça vous aide à y voir clair?

[piwi]

Première impression en lisant le texte:
60 ml de milieu c'est beaucoup! Pour une 175cm², 20 ml suffisent. A mon avis, avec 60 ml il y a un risque de noyer les cellules.
Il me semble cependant que les C2C12 sont un peu capricieuses. Je peux me renseigner, je connais deux trois personnes qui travaillent avec.

Cordialement,
piwi

[invited07ac121]

Première impression en lisant le texte:
60 ml de milieu c'est beaucoup! Pour une 175cm², 20 ml suffisent. A mon avis, avec 60 ml il y a un risque de noyer les cellules.
Il me semble cependant que les C2C12 sont un peu capricieuses. Je peux me renseigner, je connais deux trois personnes qui travaillent avec.

Cordialement,
piwi

Merci, ce serait vraiment super sympa! S'ils pouvaient te donner leur densité d'ensemencement lors d'une décongélation...

Bon en tout cas, mon volume de milieu a l'air de mettre tout le monde d'accord! La prochaine fois, je ne mettrais que 25 ml.
J'avoue que maintenant j'ai un peu la trouille de décongeler ma 2e ampoule commerciale et de potentiellement rejeter 400€ à la poubelle!
Là je viens de décongeler une ampoule de vieilles cellules mésenchymateuses que j'ai mises dans 25 ml du coup, mais vu qu'elles sont congelées depuis 2003 à -80°C, et pas à l'azote, j'ai des doutes sur leur état. Et donc, je risque de ne pas être beaucoup plus avancée!

[fabien.che]

Il y a parfois un truc très bête, c'est le plastique...

Je ne connais pas ces cellules, mais certains types cellulaires demandent un plastique traité de manière particulière.

[invited07ac121]

C'est pas idiot!
J'ai des flasks nunc EasyFlask (ref Sigma Z721921) et il n'est pas mentionné s'ils sont traités pour la culture de cellules adhérentes! Et la nana du service technique de Sigma ne trouve pas l'info non plus. D'ailleurs, elle elle me déconseille Nunc car il est toujours difficile d'obtenir des infos.
Quelqu'un sait si cette référence est pour cellules adhérentes ou pour cellules en suspension?

C'est peut-être une piste de plus.

[LXR]

Déjà quand tu décongèles, il faut que tes cellules soient le plus concentrées possible de manière à optimiser leur reprise. Généralement, je décongèle une ampoule dans un T25. En plus l'ATCC ils sont assez radins et leurs ampoules ne comptent pas plus de 500000 cellules, raison de plus pour décongeler ce genre d'ampoule dans le plus petit conditionnement possible. Lorsque je décongèle mes propres ampoules, où je mets environ 2 millions de cellules, je le fait aussi en T25 malgré le nombre énorme de cellules. Cela favorise réellement leur reprise.

J'ai du mal à comprendre qu'on te laisse gérer tout cela toute seule. La culture cellulaire ne s'improvise pas et il faut bénéficier d'un bon encadrement lorsqu'on débute de nouvelles méthodologies appliquées à la culture cellulaire, surtout pour la congélation/décongélation de cellules.

[fabien.che]

D'accord avec LXR pour la décongélation de la totalité de l'ampoule dans une seule flask.

Sinon pour le plastique, sans vouloir faire de pub, moi je préfère les flask avec des bouchons bleus...

Autre chose, j'essaye de décongeler tôt le matin, et je change le milieu le soir avant de partir. Attendre 24h, moi ça me paraît long. Mais bon, ça dépend aussi des cellules.

[invited07ac121]

Coucou à tous,

J'ai repensé à mes histoires de flasks ce week-end. S'ils n'étaient pas traités pour la culture de cellules adhérentes, mes cellules n'auraient probablement pas si bien adhéré les premières 48h.
Je pense que c'est dû à une combinaison de trop faible densité + changement de milieu un peu trop rapide, les facteurs sécrétés par mon peu de cellules étant bien dilués dans mon grand volume de milieu.

Qu'en pensez-vous?

[piwi]

Salut,

Je me suis renseigné à propos des C2C12. Selon les personnes qui travaillent avec quotidiennement, il n'y a pas d'astuces particulières.

Ces cellules poussent dans du DMEM glucose 1g/L + 20% serum (le problème vient peut être de là, vous êtiez en 10% serum).
Il ne faut pas les pousser à confluence mais les passer au max 70%. Ceci étant dit, le problème ici n'est pas tant la survie des cellules que le maintient de leur capacité à se différencier en myotubes.

Sinon, rien d'autre. 60mL de milieu est beaucoup mais ça ne devrait pas les tuer aussi vite que les votres.

Cordialement,
piwi

[invited07ac121]

Merci beaucoup de vous être renseigné!

Quant à moi j'ai décongelé ma deuxième ampoule dans un flask 75 cm², avec 15 ml de milieu et je me suis heurtée au même problème.

J'ai fait un petit test: j'ai mis du milieu dans un flask sans cellules, et j'ai pris le pH de mon milieu: 7.45.
J'ai mis ce flask à l'incubateur, et 2h après, mon milieu était vraiment très rose, et mon pH était passé, en 2h, à 8.55.
Je pense donc que j'ai un problème de CO2 dans mon incubateur, et que mes cellules n'ont pas beaucoup aimé cette augmentation de pH.

Qu'en pensez vous?

[invited07ac121]

Pour info, le réparateur de mon incubateur est passé ce matin, j'avais un problème avec la carte électronique: mon incubateur était en réalité à 0% de CO2.
D'où l'alcalinisation rapide de mon milieu.

A priori, les choses devraient rentrer dans l'ordre!

[piwi]

Ca m'est arrivé une fois. Les cellules ne passent pas la nuit. Mais il n'a pas d'alarme ton incubateur?
Sinon, question argent, faut voir le devis. Le plus intéressant pour nous était d'en acheter un neuf (finalement, coup de bol, on a pu récupérer la pièce sur un autre incubateur lui aussi out.).

[invited07ac121]

Si si il y a bien une alarme, mais comme c'était un problème de carte électronique, il me détectait 5.8% de CO2 donc pas d'alarme!
Le réparateur à bidouillé je ne sais quoi et maintenant ça marche, donc pas besoin de changer de pièce. Pour l'instant!
Le moteur fait un drôle de bruit, et il est possible qu'il lâche d'ici un an.
Lui il me conseille de rester comme ça pour l'instant et de surveiller en vérifiant que le moteur tourne, et en vérifiant le taux de CO2 et la température réels de temps en temps.
Et vu l'age de l'incubateur, il pense que le jour où le moteur lâche, ça ne vaudra pas vraiment le coup de changer le moteur, mais qu'il vaudra mieux changer l'incubateur.

En tout cas, merci à tous ceux qui on bien voulu me répondre pour leur aide, ça m'a aidé à y voir plus clair!