Questions Western Blot

[invitebef535e4]

Bonjour,
je me pose quelques questions au sujet du western blot et je n'arrive pas à y trouver de réponse.
Tout d'abord, comment fonctionne exactement un gel de concentration ? Si j'ai bien compris, il est censé concentrer en fine bandes les protéines déposées dans les puits en fonction de leur PM, mais comment cela est-il possible exactement ? Quel est le mécanisme ?
Ensuite, lors du transfert, pourquoi faut-il activer la membrane PVDF au méthanol ? Cela libère-il des groupement spécifiques grace à une réaction chimique ?

Voilà, j'espère que quelqu'un pourra m'aider. Merci d'avance en tout cas ^^.
-----

[invite02e16773]

Salut,

Je te conseille cette page : http://www.cours-de-biochimie.fr/western-blot.php

[invitebef535e4]

Merci pour ton message mais il ne répond qu'à la première de mes question puisque le site ne traite que de la partie électrophorèse et pas du transfert sur membrane...

[invite205e2302]

Hmm, il me semble que le méthanol permet de rendre la membrane PVDF (plutôt hydrophobe) hydrophile et de faciliter ainsi les transferts. Les membranes de nitrocellulose ne nécessitent pas ce traitement au méthanol pour que les transferts s'effectuent.

Ma réponse ne se base que sur de vagues souvenirs de cours de bio cell, donc à vérifier, mais tu peux éventuellement faire des recherches dans ce sens.

Si quelqu'un a une réponse sûre, cela m'intéresse aussi.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

je n'utilise pas le PVDF mais je n'ai pas réussi a trouver l'information. Cylianide doit être dans le vrai.

[inviteae6c05c4]

Je confirme l'utilisation du méthanol pour l'hydratation de la membrane PVDF.

[Edelweiss68]

Ce sujet me disait quelque chose... Il faut juste faire abstraction du message n°2...

http://forums.futura-sciences.com/bi...-methanol.html

[invitebef535e4]

Merci beaucoup Edelweiss, ton lien m'aide à tirer tout ça au clair.

[Edelweiss68]

Et bien tant mieux!

[invite71f23525]

Oui enfin, mon message dans la discussion donnée en lien n'était qu'une supposition logique, je n'ai jamais eu aucune preuve concrète. Mais la plupart des personnes pensent la même chose (cf message de Cylianide et fabien.che). La vérité ne doit pas être bien loin, ça devrait suffire tant qu'on ne veut pas faire une publication visant à améliorer la technique de western blot.

[gorben]

Pour info, il est tout a fait possible de "mouiller" la membrane avec de l'ethanol... moins toxique et tout aussi efficace !

[invite71f23525]

Le pouvoir de mouillabilité de l'éthanol est tout de même inférieur à celui du méthanol, ce dernier étant plus hydrophile. J'étais passé pendant un certain temps à l'éthanol, que ce soit pour mouiller le PVDF ou transférer, et j'ai trouvé que l'efficacité du transfert était inférieure au transfert avec méthanol. Je suis donc repassé au méthanol malgré sa toxicité.

[invite22c08ba2]

Bonjour,

Sur le même topic : j'utilise des membranes PVDF. Seulement ma membrane a séchée (exposition O/N) : si je la réactive dans de l'éthanol et que je la stripp : cela va-t-il refonctionner ?

[Flyingbike]

ca coute rien d'essayer (mais pas dans l'etoh) mais moi j'ai arrêté de conserver des membranes...

[invitebef535e4]

Normalement, réactiver en éthanol ou mieux en méthanol est censé marcher.

Ceci dit, une membrane qui a séché en a forcément pris un coup donc je te conseillerais :
-de retenter le coup avec ta membrane uniquement si tes anticorps sont de bonne qualité / ta protéine se révèle facilement. Si c'est pour une hybridation plus délicate, tu risques d'avoir un résultat de mauvaise qualité.
-de ne pas stripper si tu peux l'éviter (protéine pas de même poids moléculaire que la première)

Bon courage !

[invite22c08ba2]

Merci pour ces réponses, cependant il y a plusieurs points que je ne comprends pas :
- si l'activation de la membrane la rends hydrophile et est utile pour le transfert : pourquoi faudrait-il la réactiver avant de repasser un anticorps dessus ?
- et pourquoi lorsque l'on stripp on a une protéine a un poids moléculaire différent de la première ?

En tout cas j'essaye je vous tiens au courant !