synthèse cDNA double brin

[invite9a0d97fd]

Bonjour,

Je dois synthétiser de l'ADNc double brin à partir de 10µg d'ARN totaux. J'utilise le kit Double stranded cDNA synthesis d'Invitrogen (enzyme superscript II).
J'utilise des oligodT puis une étape de RNAse A pr dégrader mes ARNr.
Je me retrouve avec seulement une 10aine de ng/µL de cDNA...
Ce qui n'est pas suffisant pr réaliser le marquage et l'hybridation de mes puces (microarrays Nimblegen).
Quelqu'un a-t-il déjà utilisé ce kit?
J'aimerais avoir une idée du rendement que je devrais obtenir en partant de 10 µg d'ARN tot., je me demande si ce très faible rendement est normal ou si j'ai loupé une étape...
Merci d'avance pour vos réponses
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[Flyingbike]

Bonjour,

Non ce n'est pas normal, as-tu vérifié l'état de tes ARN avant RT ?

[invite9a0d97fd]

Bonjour,

Oui je les ai vérifié au bioanalyseur, ils sont nikels.
Mais bon, ceux que je vois ce sont les ARNr...

[invite71f23525]

Bonjour,

J'utilise des oligodT puis une étape de RNAse A pr dégrader mes ARNr.

Je ne comprends pas ce passage. La RNase A n'est pas sensée être spécifique des ARNr il me semble...?

Autre chose, avec quelle méthode et quel blanc as-tu dosé les ADNc?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9a0d97fd]

Merci pour ta réponse,
Oui la RNAse A est spécifique aux ARNr.
J'ai dosé mes ADNc au Nanodrop avec de l'eau RNase/Dnase free comme blanc

[invite71f23525]

A quoi te sert la dégradation spécifique des ARNr?

Après la RT et l'étape de dégradation avec la RNase, as-tu effectué une purification de tes ADNc pour te débarrasser de toutes les enzymes et tampons utilisés?

[Flyingbike]

Je ne pense pas qu'une RNase puisse être spécifique des ARNr, si ? La RNase A n'est pas mentionnée spécifique en tout cas.

[invite9a0d97fd]

Oui, j'ai fait une purif.
J'ai dégradé mes ARNr parce que sinon je les dosais et les voyais sur gel.
Alors que je n'ai besoin que de mes ADNc pr mon marquage/hybridation ensuite.
Et surtt, il me faut connaître leur concentration exacte et leur qualité pr la suite des manips.

[Flyingbike]

visiblement la RT ne se passe pas bien. Comment procèdes-tu ?

Il ne serait pas plus judicieux de traiter a la RNase après synthèse du premier brin, de nettoyer tout ça et de procéder ensuite à la synthèse du complémentaire ?

[invite9a0d97fd]

Je suis à la lettre le protocole du kit:
- synthèse du 1er brin: ARN total + oligodT +l'enzyme superscript II (RT)
(+ tampon, DTT et dNTP)
- synthèse du 2nd brin: DNA ligase + DNA polymerase + RNase H
(+ tampon et dNTP) + EDTA
- Etape RNAse A
- Phénol/Chlo./IAA
et précipitation acétate ammonium/ETOH 100 (+ lavage à ETOH 70)
ADNc resupendus dans eau RNAse/DNase free
(+ dosage nanodrop)

Merci pour ton aide

[Flyingbike]

tu devrais doser ton mix avant et apres la synthèse du premier brin, il devrait y avoir une augmentation. Ca te dirait si la RT se passe bien. A la fin, en précipitant, tu as un culot au moment de rincer ?

[invite9a0d97fd]

Effectivement, j'aurais jamais pensé à doser mon mix, c'est une bonne idée merci
Non, je ne vois pas de culot au moment de resupendre mes cDNA.
J'ai contacté Invitrogen parce que je comprends vraiment pas d'où vient ce pb de rendement!

[gorben]

Salut,

J'ai utilise ce kit il y a peu. Sur 6ug d'ARN totaux bacterien, en utilisant des randoms primers j'ai recupere 2.5-4 ug d'ADN double brin...

A+

[Flyingbike]

c'est pas mal. Mais vu que jo21 utilise des oligodT, il ne faut pas s'attendre a quelque chose de semblable, les ARNm a polyA étant minoritaire par rapport aux ARNr.

[invite9a0d97fd]

Merci à tous pour vos réponses.
C'est la 1ere fois que j'utilise ce genre de forum.
Je trouve ça super de votre part de me répondre et m'aider.