Question de mon examen d'immunologie

[inviteaacbb360]

Bonjour à tous,

En juin, j'ai eu un examen d'immunologie, avec diverses questions, mais il y a une en particulier à laquelle je ne sais pas du tout répondre !

J'espère que quelqu'un habitué aux techniques en immunologie pourrait m'aider un peu... Dans les techniques d'immunologie, j'ai vu le Western Blot, ELISA, la cytométrie de flux, mais je ne sais plus très bien si ma prof a parlé d'autres techniques... Cependant je n'arrive pas à associer quelles valables pour les questions suivantes :

"On étudie Protéine PGDF, et son récepteur PGDF-(Beta) sur des pericytes. Par des techniques vues au cours, (justifier)

- déterminer si une protéine est sécrétée?
- déterminer si une protéine est produite?
- déterminer si récepteur est présent en surface?
- déterminer si récepteur est fonctionnel?
- déterminer si le récepteur peut se combiner sous forme de hétérodimère comme par exemple avec VEGFR2?*

*La dernière question, je ne comprends pas très bien ce qu'on veut faire, s'agit-il de mettre les 2 récepteurs ensemble ?

Merci d'avance à toute personne qui pourrait me donner un p'tit coup de cerveau !
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[inviteaacbb360]

Pour la protéine sécrétée, je suppose qu'il faut faire une centrifugation d'un échantillon, et utiliser WB ou ELISA pour la trouver...

Pour la protéine produite, je suppose que la prof a voulu dire qu'elle reste au niveau de la membrane cellulaire ou bien dans le cytoplasme, donc il faut lyser les cellules pour accéder à leur contenu, puis WB ou ELISA

Pour le récepteur, j'ai pensé à l'utilisation de la protéine marquée, puis WB ou ELISA mais je ne sais pas si on peut le faire autrement...

Maintenant pour voir si le récepteur est fonctionnel, je ne sais pas trop comment faire... Comment savoir s'il fonctionne, puisque pour savoir qu'il fonctionne, il faut qu'on puisse savoir qu'il est là...

Enfin, pour la dernière question, je ne sais pas du tout en quoi ça consiste :/

[TanguyE]

Bonjour,

Pour la protéine sécrétée, je suppose qu'il faut faire une centrifugation d'un échantillon, et utiliser WB ou ELISA pour la trouver...

Ça me parait cohérent comme solution, si c'est à partir d'une biopsie. Si c'est à partir d'une culture cellulaire, prélever le surnageant me parait plus adapté. Après WB ou ELISA a toi de trancher bien que le WB soit un peu plus facile à faire dans ce cas là.

Pour la protéine produite, je suppose que la prof a voulu dire qu'elle reste au niveau de la membrane cellulaire ou bien dans le cytoplasme, donc il faut lyser les cellules pour accéder à leur contenu, puis WB ou ELISA

Là pas de soucis. Même remarque que plus haut pour WB/ELISA.

déterminer si récepteur est présent en surface?

Pour celle ci , tu as oublié une technique d'immuno: l'immunofluorescence indirecte (IFI). Normalement si ton récepteur est en surface, ça dervai être noël sur tes membranes cellulaires au microscope

- déterminer si récepteur est fonctionnel?
- déterminer si le récepteur peut se combiner sous forme de hétérodimère comme par exemple avec VEGFR2?*

Pour ces 2 là je suis moins sur de moi, mais je dirai bien IFI aussi avec 2 Ac marqués par 2 fluorochromes différents pour faire de la co-localisation. Par exemple si tu met un Ac anti-récepteur couplé à un fluorochrome vert et un Ac anti-protéine rouge, tu regarde si les points rouges et les verts sont au même endroit sur tes cellules. Même principe pour l'hétérodimère.

J'espère avoir pu t'aider.

[inviteaacbb360]

Merci pour la réponse, ça m'aide bcp !

Juste encore une question, un hétérodimère, ce serait un mélange des 2 récepteurs en fait ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[TanguyE]

De rien

Oui dans ce cas un hétérodimère serait composé d'un récepteur PGDF et d'un VGEFR2.

[inviteaacbb360]

Aaah j'y vois encore plus clair maintenant !

Encore une fois, merci beaucoup !

[invite98ab1ae6]

Hi!
POur detecter si le recepteur forme un dimere, en partant du principe qu'on ne connait pas l'autre proteine, on pourrait utiliser une co-immunoprecipitation, non?
lien

[TanguyE]

En effet, j'avais oublié cette technique.

De toute façon ce qui compte dans ton exam c'est de justifier le pourquoi de ta réponse donc quelle que soit la méthode que tu retiens au final, mis à part sa pertinence vis à vis de la question, le plus important est de dire en quoi elle permet de répondre à l'intérogation. Cette remarque vaut pour les 2 premières questions ou tu as le choix entre ELISA et WB

[inviteaacbb360]

Ah ben merci pour l'info en plus ! ^^

[invite3b5f5a07]

Salut

- déterminer si récepteur est présent en surface?

Tu peux utiliser la cytométrie de flux, ainsi tu pourras quantifier la proportion de cellules positives/négatives

- déterminer si récepteur est fonctionnel?

Généralement pour tester la fonctionnalité il faut connaitre la fonction de la protéine, dans ce cas précis à toi de voir si une telle connaissance était supposée acquise

- déterminer si le récepteur peut se combiner sous forme de hétérodimère comme par exemple avec VEGFR2?*

Là encore tu pourrais envisager une cytométrie de flux, voir FRET si possible ?

[invite71f23525]

Un récepteur peut être considéré fonctionnel si l'on démontre qu'il est capable de fixer son ligand avec une bonne affinité.

Dans ce cas, si son ligand est connu (seul moyen de regarder s'il est fonctionnel à ce niveau là), il suffit d'utiliser son ligand radiomarqué avec la technique SPA (Scintillation Proximity Assay). Cette technique consiste à fixer son récpteur recombinant sur des billes remplies de scintillant. Lorsque le ligand radiomarqué se fixe à son récepteur, la proximité du radioisotope avec le scintillant fait briller les billes. Ainsi en dosant la luminescence avec un luminomètre, on peut quantifier la liaison du ligand à son récepteur en faisant des déplacements compétitif du ligand chaud (radiomarqué) par du ligand froid (non radiomarqué). On peut alors déterminer le Kd qui peut permettre de déduire si le récepteur est fonctionnel ou pas.

Le deuxième aspect de sa fonctionnalité est son activation par la fixation de son ligand. Le PDGFR est un récepteur tyrosine kinase, c'est à dire que la fixation de son ligand induit sa dimérisation avec un autre récepteur tyrosine kinase. Leurs domaines cytoplasmiques catalytiques s'autophosphorylent ce qui permet l'activation de leur activité tyrosine kinase. Tu peux donc exploiter cette connaissance en effectuant un essai kinase. Je suppose que pour ton cas, tu peux te servir d'un extrait cellulaire de ton récepteur activé (c'est à dire des cellules traitées au PDGF) et de l'incuber en présence d'un substrat connu de son activité kinase, le tout en présence d'ATP gamma 32P. En autoradiographie, si le substrat est phosphorylé, le récepteur est fonctionnel.
Une autre méthode consiste à faire un western blot des cellules exprimant ton récepteur activé par le PDGF, avec un anticorps dirigé contre une phospho-tyrosine d'un substrat de l'activité kinase du PDGFR. Si tu observes une stimulation du signal entre la condition ou le récepteur n'est pas activé et la condition ou PDGF a été ajouté, c'est que ton récepteur est fonctionnel. Un biais persisterait, c'est que cette phosphorylation détecté par l'anticorps anti-phospho-tyrosine du substrat pourrait très bien être catalysée par une autre kinase indépendant de la voie du PDGFR. Dans ce cas, tu peux faire le même western blot sauf que tu y ajoutes une condition siRNA COntrol et siRNA PDGFR (enfin là ça commence à devenir très pointilleux tout de même, un essai kinase ou un western blot simple devrait suffire ).

[inviteaacbb360]

Merci beaucoup à tous pour les infos !