clonage

[invitef496d149]

Bonjour à tous,
j'ai besoin de votre aide en urgence, en fait depuis deux mois j'essaye de réussir un clonage mais pas moyen, c'est un clonage simple comme rien mais je ne sais pas où ça coince.
j'ai digéré mon vecteur et mes deux inserts en double digestion, ligation, transformation de la NM522 et......la première tentative j'en avait une 50aine de clones mais la PCR n'a révelé aucun clone positif mais pour toutes les autres tentatives je n'ai eu aucun clone que se soit sur le clonage proprement dit ( vecteur+ 2 inserts+ligase) que pour les deux autres controle (vecteur+ligase, vecteur seul).
j'ai changé ma ligase, le temps de ligation, le lot de mes competente mais toujours rien, je commence à me déséperer alors que ce clone m'est nécessaire.
en attendant de lire vos suggestions veulliez accepter mes sincères salutations
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[invite14397db8]

Le produit du gène que tu essaies de cloner est peut-être toxique pour tes bactéries.

EDIT: Ah, si même tes contrôles avec le vecteur vide ne révèlent rien, ça n'est pas ça. A tout hasard, tu as vérifié que ce n'est pas un petit comique qui a intervertit deux flacons d'enzymes de restriction?

[invitef496d149]

Le produit du gène que tu essaies de cloner est peut-être toxique pour tes bactéries.

EDIT: Ah, si même tes contrôles avec le vecteur vide ne révèlent rien, ça n'est pas ça. A tout hasard, tu as vérifié que ce n'est pas un petit comique qui a intervertit deux flacons d'enzymes de restriction?

et comment je peux le savoir?

[invite853321bf]

Tu utilises un antibiotique pour vérifier la présence du plasmide ? Ca m'est arrivé une fois, l'antibiotique n'était plus viable, donc les bactéries ne gardaient pas les plasmides.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite14397db8]

et comment je peux le savoir?

Fais une digestion de ton plasmide avec tes enzymes, puis tu fais une électrophorèse sur gel ( de ton plasmide). Si tu as fait une digestion avec deux enzymes, tu devrais voir deux fragments en principe.

[piwi]

Non pas nécessairement. Si les deux sites de restrictions sont dans la cassette de clonage (ce qui doit être le cas), alors on retire entre 10 et 50 pb que l'on ne verra pas sur gel. Le plasmide semblera simplement linéarisé.

Si vous souhaitez une aide constructive, il vous faudra détailler plus votre protocole.
Les inserts sont obtenus comment? Quelle quantité de vecteur et d'inserts dans la ligation? Quelles enzymes? etc...

Cordialement,
piwi

[invitef496d149]

Non pas nécessairement. Si les deux sites de restrictions sont dans la cassette de clonage (ce qui doit être le cas), alors on retire entre 10 et 50 pb que l'on ne verra pas sur gel. Le plasmide semblera simplement linéarisé.

Si vous souhaitez une aide constructive, il vous faudra détailler plus votre protocole.
Les inserts sont obtenus comment? Quelle quantité de vecteur et d'inserts dans la ligation? Quelles enzymes? etc...

Cordialement,
piwi

biensure que je veux une aide et plus que constructive,
mes inserts sont des produits de PCR, sur gel d'agarose c'est Ok j'ai des fragments avec les tailles attendues, les enzymes utilisées sont pour le plasmide BamH1-HF-EcoRI HF, pour le premier insert BamHI HF-NdeI et pour le second: NdeI-EcoRIHF, pour les quantités j'ai utilisé un rapport de 1-5 et dans une autre tentative1-3

[invite853321bf]

Tu utilises un antibiotique pour vérifier la présence du plasmide ? Ca m'est arrivé une fois, l'antibiotique n'était plus viable, donc les bactéries ne gardaient pas les plasmides.

Je me répète

[invitef496d149]

Je me répète

oui, mais vous me proposer quoi comme solution

[invite853321bf]

Tester l'antibiotique en faisant par exemple un antibiogramme ou plus simplement prendre un nouveau lot d'antibiotiques

[invitef496d149]

Tester l'antibiotique en faisant par exemple un antibiogramme ou plus simplement prendre un nouveau lot d'antibiotiques

l'ATB fonctionne parce que les autres clonages ont bien poussé

[piwi]

Je ne suis pas certain d'avoir compris les contrôles:
Vecteurs seul, c'est vecteur seul digéré?
Normalement ce devrait être le cas.

Si les choses sont ainsi qu'elles devraient être:
Vecteur seul: linéaire, ne doit pas pousser
Vecteur seul + ligase: double digestion, ne doit pas religuer, ne doit pas pousser
Vecteur + inserts + ligase: devrait pousser.

Ceci nous dit quand même quelque chose sous réserve que vous n'ayez pas dephosphorylé vos vecteurs (CIP). Comme le contrôle vecteur + ligase ne pousse pas, c'est que votre double digestion est effective. Du coup le problème se trouverait plutôt dans les inserts.
D'où proviennent les sites de restrictions de vos inserts? Sont-ils sur les oligos? Si oui, avez-vous contrôlé qu’ils soient corrects ? Toujours dans la même optique, si les oligos sont corrects en théorie, ont-ils été purifiés HPLC ? Il peut toujours y avoir eu une erreur à la synthèse.

Comment screenez vous vos colonies ? Avec des oligos externes ?

Voyons déjà cela.
Cordialement,
piwi

[invitef496d149]

Je ne suis pas certain d'avoir compris les contrôles:
Vecteurs seul, c'est vecteur seul digéré?
Normalement ce devrait être le cas.

Si les choses sont ainsi qu'elles devraient être:
Vecteur seul: linéaire, ne doit pas pousser
Vecteur seul + ligase: double digestion, ne doit pas religuer, ne doit pas pousser
Vecteur + inserts + ligase: devrait pousser.

Ceci nous dit quand même quelque chose sous réserve que vous n'ayez pas dephosphorylé vos vecteurs (CIP). Comme le contrôle vecteur + ligase ne pousse pas, c'est que votre double digestion est effective. Du coup le problème se trouverait plutôt dans les inserts.
D'où proviennent les sites de restrictions de vos inserts? Sont-ils sur les oligos? Si oui, avez-vous contrôlé qu’ils soient corrects ? Toujours dans la même optique, si les oligos sont corrects en théorie, ont-ils été purifiés HPLC ? Il peut toujours y avoir eu une erreur à la synthèse.

Comment screenez vous vos colonies ? Avec des oligos externes ?

Voyons déjà cela.
Cordialement,
piwi

oui mes sites de restriction sont dans les oligos, je les ai verifier hier, il n y a pas d'erreur . et en la PCR fonctionne
je screene mes colonies ( lorsque j'en avait avec les oligos qui ont servi au clonage

[piwi]

Une autre question idiote mais qui vaut son pesant de cacahuetes: vous avez changé laligase, mais avez vous changé aussi le tampon ligase? En particulier êtes vous certaines qu'il y a bien de l'ATP dans le tampon (2.5 mM final normalement)? Parce que c'est une source fréquente d'échec de ligation cette histoire.
Avez vous dans le même temps des ligations correctes sur d'autres clonages qui fonctionnent?

Cordialement,
piwi

[invitef496d149]

Une autre question idiote mais qui vaut son pesant de cacahuetes: vous avez changé laligase, mais avez vous changé aussi le tampon ligase? En particulier êtes vous certaines qu'il y a bien de l'ATP dans le tampon (2.5 mM final normalement)? Parce que c'est une source fréquente d'échec de ligation cette histoire.
Avez vous dans le même temps des ligations correctes sur d'autres clonages qui fonctionnent?

Cordialement,
piwi

oui j'ai utilisé son tampon appropié qui contient de l'ATP, en fait j'avais en parallèle un autre clonage qui n'a pas marché je voulais dire où je n'ai eu aucun clone mais en changeant le temps de la ligation ça a fonctionné mais pas pour celui-ci sinon les autres ligations ( pour d'autres clonages) dans le même temps je n'ai eu aucun problème et ça a marché du premier cout

[Flyingbike]

y a-t-il assez de bases de part et d'autres des sites de restriction sur les oligos ? Certaines enzymes ne peuvent digérer au bord du brin et ont besoin de quelques bases pour avoir une bonne "assise".

[invitef496d149]

y a-t-il assez de bases de part et d'autres des sites de restriction sur les oligos ? Certaines enzymes ne peuvent digérer au bord du brin et ont besoin de quelques bases pour avoir une bonne "assise".

forward 6bases et en reverse 3 où je coupe avec EcoRI

[invitef496d149]

Bonjour
merci à tous ceux qui ont essayer de m'aider à résoudre mon problème de clonage.
Enfin je l'ai réussi et à 100%. j'ai essayé une autre ligase d'un autre fournisseur et je n'ai obtenu que 9 clones mais qui sont tous positif
merci encore une fois

[piwi]

Bonjour,

Heureux d'avoir de vos (bonnes) nouvelles. Ca fait toujours plaisir d'avoir un retour.

Comme je vous le disais, la ligase est une étape critique et l'ATP contenu dans le tampon est fragile. On a vite fait d'avoir une efficacité pourrie, sinon nulle, à cette étape. Une petite leçon pour l'avenir

Cordialement,
piwi