adaptation protocole confocal à cytométrie en flux

[invite135dbc80]

Bonjour,

j'utilise un marquage anticorps pour localiser une toxine dans le corps cellulaire de cellules adhérentes jusqu'à maitenant, j'ai uniquement utilisé de l'imagerie confocale et je voudrais passer à la cytométrie en flux pour évaluer le pourcentage de cellules marquées (contenant de la toxine).
Pour le moment mon proto de marquage est :

traitement
fixation à la PFA 4%
perméabilisation au triton
saturation à la BSA
incubation overnight avec Ac primaire
5 lavages
incubation avec le secondaire
5 lavage
marquage DAPI

Mon problème est que dans tous ce que j'ai pu lire, pour la cytoflux l'incubation avec les Ac semble se faire sur cellules en suspension et pendant quelques minutes (30 minutes) seulement.
Du coup, j'ai peur qu'avec une incubation si courte je n'ai pas/peu de marquage
Est-il possible de maintenir mon protocole initiale en ne trypsinnant qu'à la fin ? ou la trypsinne risque -t-elle de dégrader mon marquage?

Merci

artémis
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[Flyingbike]

si tu trypsines apres avoir perméabilisé, je pense que tu vas avoir des surprises

il faut tester, des cellules en suspension n'auront peut être pas la meme sensibilité que des cellules adhérentes. A mon avis la meilleure méthode c'est de perméabiliser et de faire les marquages apres avoir détaché les cellules.

[invite71f23525]

Généralement pour des marquages de cellules adhérentes pour du FACS, on trypsine, récupère les cellules, on les compte, on centrifuge la quantité de cellules voulues (autour de 500000 en général), on les reprend par un faible volume de PBS (autour de 300 µl) et on les projette dans de l'éthanol (pourcentage à définir) pour les fixer. A partir de là, on continue avec les protocoles classiques de marquage.

Si tu as peur que l'intégrité de la membrane plasmique ait souffert à cause de la trypsine, je te rassure, cette méthode est employé pour faire des marquages AnnexinV / PI qui repose essentiellement sur les propriétés de la membrane plasmique (flopping de la phosphatidylsérine pour annexinV, perméabilité de la membrane pour PI) pour discriminer les stades de mort cellulaire. Il vaut mieux que la membrane plasmique reste intacte pour ce marquage qui marche bien de cette façon donc pas de souci de ce côté là. La trypsine n'est pas une enzyme liposoluble donc elle reste bien en dehors des cellules et n'attaque que les protéines de surface.

[invite135dbc80]

merci pour les infos,
en fait mes inquiètudes viennent plus des diffcultés que j'ai rencontré pour mettre au point un marquage spécifique avec mon anticorps primaire...
du coup j'ai d'autres questions :

- dans mon protocole de marquage 'classique', j'incubais mon primaire overnight à 4°C et dans la plupart des protocoles pour cyto flux le temps d'incubation est plus de l'ordre de la demi heure à 4°C...
Du coup, je me demandais si c'était lié au fait que les cellules étaient plus facilement marquées en suspension ou si il valait mieux que je maintienne mon incubation overnight.

- De plus comme je viens de le dire pour obtenir un marquage spécifique dans mon modèle cellulaire, je dois réaliser de nombreux lavage avec du PBS + détergent (pour déstabiliser les liaisons non spécifique) pensez vous que cela soit compatible avec la cytométrie en flux, j'ai un peu peur que les manipulation successive des cellules ne les abîmes trop et les rendent inexploitables....

Merci beaucoup !

[A voir en vidéo sur Futura]