Perméabilisation cellulaire

[v_711]

Bonjour à tous.

Je me pose une question à laquelle personne ne sait me donner de réponse satisfaisante.

J'ai une manip qui consiste à marquer une protéine du cytosquelette à l'aide de 2 anticorps (primaire + secondaire porteur d'un fluorophore).
La manip fait intervenir du paraformaldéhyde pour fixer les cellules, puis du Triton X pour perméabiliser les membranes. On ajoute ensuite les anticorps un à un... etc...

Je m'interroge sur ces premières étapes du marquage :

- Le paraformaldéhyde forme des bases de Schiff sur les amines des protéines.
J'imagine donc que les protéines cytoplasmiques restent libres, et peuvent se mouvoir plus ou moins aisément.

- Le Triton X étant un tensio-actif, j'imagine qu'il interagit avec les phospholipides membranaires. Son effet perméabilisant vient-il d'une désorganisation de la bicouche ?
Et qu'entend-on réellement par perméabilisation ? Est-ce que les anticorps passent à l'intérieur de la cellule par diffusion ?
Si tel est le cas, j'imagine qu'une petite protéine restée libre dans le cytoplasme pourrait tout aussi bien diffuser vers l'extérieur lors des rinçages...


Qu'en pensez-vous ?
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[piwi]

La PFA fixe toutes les protéines. Pourquoi ne fixerait elle (il? Je ne sais jamais) pas celles du cytoplasme?

[v_711]

Je suis d'accord ; toutes les protéines sont touchées.
Mais qu'entend-on par "fixer" au niveau moléculaire ?

[Edelweiss68]

Et bien en formant la base de Schiff, il se lie aux protéines par la fonction amine comme vous l'avez dit.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Edelweiss68]

Je suis d'accord ; toutes les protéines sont touchées.
Mais qu'entend-on par "fixer" au niveau moléculaire ?

Réponse toute faite en fait! http://forums.futura-sciences.com/bi...-fixation.html

[v_711]

OK. Voila qui devient plus clair.
Je ne comprend toutefois pas comment on peut former un "maillage".
J'expose ma vision des choses ; à vous de la détruire

J'utilise une solution de "PFA à 4%".
J'imagine qu'en milieu aqueux, le polymère de PFA se décompose en monomères de formol.
Pour moi, seule la fonction aldéhyde est capable d'attaquer les amines --> ce qui revient à dire que seul le formol est capable d'attaquer les protéines.
Le PFA contient 2 fonctions alcool et n'est donc pas susceptible de former des bases de Schiff (à moins qu'il ne puisse se déprotonner dans du PBS ???). De toute façon, j'imagine que ma solution est constituée de formaldéhyde et non de PFA.

Et donc, lorsqu'une molécule de formol s'est additionnée à une amine, la réaction s'arrête.
Quid des pontages "inter-protéiques"... ?

[v_711]

Voici une référence intéressante qui fonde un peu plus mes doutes :

Goldenthal K.L., Hedman K., Chen J.W., August J.T., Willingham M.C., 1985, Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins, The journal of histochemistry and cytochemistry, 33(8):813-20.

(en accès libre)

[piwi]

Que les détergents lysent les membranes et posent des problèmes pour les protéines membranaires n'est pas un nouveau problème. Mais ça ne veut pas dire qu'il y a une fuite de protéines. Cela veut dire que les protéines membranaires, ont besoin des membranes pour être structurées et que si on abime ces membranes, on abime aussi les protéines membranaires.

Cordialement,
piwi