le clonage impossible, ou comment se prendre la tete...

[inviteea735eb9]

Bonjour a toutes et a tous,
je place bcp d espoir dans ce forum car malheureusement jusqu a aujourd hui je n ai pu trouver de solution a mon probleme qui est le suivant :
Je desire sous-cloner un fragment de clone moleculaire HTLV dans pUC19 afin de pouvoir proceder a une mutagenese dirigee sur ce fragment pour ensuite le reintroduire ds le clone moleculaire.
J ai donc extrait ma sequence d interet en digerant mon clone moleculaire par Sal1 et EcoR1. Mon insert a une taille de 3200kb, bien visible sur gel d agarose. D ailleurs je purifie celui ci a partir du gel par un systeme de colonne Qiagen classique. En parallele, je digere mon pUC19 (2600kb) par les memes enzymes et le purifie de la meme maniere (j ai egalement fais cette approche sur peGFP-N1 qui contient lui aussi Sal1 et Ecor1). Je procede ensuite a la ligation dans 20 microl avec un rapport 1/1 et 1/3 en vecteur/insert. J utilise la DNA ligase O/N a 16 degres. Je transforme 5microl et 15 microl de ma ligation ds des TOP10 chimiquement competentes.. apres plus d un mois d essai, je n ai tjs rien sur mes boites, et la je suis prete a aller poser qques cierges pour Ste Rita, patronne des causes deseperees.
J ai verifie les antibio, les bacteries, dephosphoryle ou pas mon vecteur, change ma ligase, changer de vecteur, rien n y fait... je n ai malheureusemnt pas d electroporateur a ma dispo, dc je dois rester sur des bacteries chimiocompetentes.
Pour la premiere fois j'utilise des enzymes de restrictions de chez Fermentas, et je me demande si, meme si je n ai jamais du le faire avant avec les enzymes NEB, je devrais inactiver mes enzymes ?
Mon insert est il trop gros par rapport a mon vecteur? Devrais je essayer d autres rapports insert vecteur, sachant que l insert est plus grand que mon vecteur?
Qquun a t il deja eu des soucis avec des digests Sal1-EcoR1?

J attends vos suggestions avec impatience car j ai l impression d avoir tout verifie.. en plus j ai deja reussi des clonages bcp plus compliques que ca.. comme quoi en bio mol, ce qu on croit etre "simple" ne l est pas toujours, loin de la...

merci par avance et bonen chance dans vos manips !!
-----

[inviteea735eb9]

oups bien sur je voulais dire pour la taille de l insert 3200pb et non kb.. idem pour le vecteur, 2600pb et non kb... commence a fatiguer moi ...

[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Pour commencer, n'est-il pas possible de procéder à la mutagenèse dirigée directement sur le clone moléculaire? Cela simplifierait beaucoup les choses (pas de sous-clonage).

[inviteea735eb9]

Bonjour LXR et merci pour la bienvenue..
J ai commence par ce que tu me proposes, bien sur. Seulement, meme avec le kit de mutagenese XL expres pour les grands vecteurs (le mien fait 13kb) ca ne fonctionne pas... De plus, j ai constate que les autres equipes travaillant sur ce meme clone moleculaire avaient le meme souci et devaient elles aussi passer par un sous clonage... qui est different du mien bien sur, sinon ca serait trop simple

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Bonjour,

Il me semble que SalI est une enzyme pourrie qui coupe plutôt mal. Tout cela pour dire que l'on ne part pas sur des bases optimales. Mais ça devrait quand même marcher.
Vous digérez combien de µg de plasmide donneur et receveur? Parce que si vous travaillez avec 10 ng.... En même temps, vous indiquez voir les bandes sur gel, donc à priori vous en avez assez. Comment organisez vous le clonage proprement dit? Vous coupez la bande sur gel et vous purifiez? Votre bande contient elle du BET? Le BET pose de gros soucis pour les clonages.
Le truc idiot mais qu'il faut parfois regarder. Vous êtes certaine d'utiliser les bons antibio? Si le vecteur est Kana et que vous sélectionnez sur Ampi, ça va beaucoup moins bien marcher ^_^

Cordialement,
piwi

[inviteea735eb9]

Hello Piwi!
Je digere 2 microg de plasmide donneur et receveur. J ai une quantite suffisante car mes bandes st tres visibles sur gel. J utilise du Sybersafe qui est un intercalant aussi, comme le BET. Je coupe la bande sur gel et purifie sur colonne. Je n avais jamais entendu parler de souci a cause de l intercalant, et jusqu a present je n ai meme jamais envisage que ce puisse etre problematique... comment savoir si c est cela le probleme?
Pour les antibios pas de soucis, j utilise les bons. J ai fait d assez nbreuses fois la boulette pdt ma these pour ne plus la refaire
Au fait, on peut peut etre se tutoyer si vs etes d accord
Merci pour votre reponse!!
Cordialement,
Trompette

[piwi]

Pas de souci pour le tutoiment.

Les agents intercallants sont une vraie plaie pour les clonages, et l'extraction sur gel n'est pas non plus vraiment super.
Si je dois en passer par là ce que je fais c'est que je fais migrer deux fois en parallèle ma digestion dans un gel sans intercallant. La moitié du gel est colorée et enveloppée dans du saran. Ensuite je reconstitue mon gel sous lampe UV et je découpe la région du gel non coloré en regard de la bande visible sur le gel coloré. Ca regle déjà un souci. Pour l'extraction j'ai déjà eu ce genre de soucis. Pas top, j'avais pas vraiment fais de miracles.

Une solution confortable, que j'aime bien, est d'amplifier l'insert par PCR avec des oligos portant les sites de restriction (+6ntds). Une digestion par DpnI (pour éliminer le vecteur matrice) et c'est propre pour les digestions. On évite de passer sur gel et on se fait beaucoup moins suer!

[inviteea735eb9]

En effet Piwi, j ai pense a l insertion de sites de restriction par PCR. Le truc c est que je me dis que inserer des sites de restriction qui sont deja presents ds ma sequence, ca revient un peu au meme. Je ne peux pas introduire des sites de restriction plus "classiques" car apres je dois religuer cet insert ds le clone moleculaire original digere par EcoR1 et Sal1. Mais, qqch me taraude : apres ta digestion, tu ne purifie pas sur gel avant ta ligation?

[invite6db66ef2]

Bonjour Trompette !

J'ai exactement le même problème que toi, également pour un clonage très simple : je veux extraire la séquence codante (750 pb) de mon vecteur d'expression pUSE-Amp (5.5 kb) puis religuer le vecteur vide afin d'avoir un contrôle négatif pour mes transfections.
Comme toi je digère mon plasmide avec 2 enzymes de restriction qui produisent des bouts cohésifs complémentaires (XbaI et NheI), puis je fais migrer sur gel (mais je "colore" avec du BET) puis je découpe mes bandes, purifie sur colonne en utilisant le même kit de purification que toi, puis je fais une ligation o/n à 16°C. Enfin, je transforme 10 ul de mon mix de ligation dans mes bactéries chimiocompétentes XL-1 bleues. J'ai également essayé en parallèle de digérer avec XbaI et EcoR1 puis de créer des bouts francs avec la Klenow et de religuer en ajoutant du PEG (5%) à mon mix de ligation.
Je suis sure d'avoir utilisé le bon antibio puisque comme contrôle de transfo j'ai utilisé mon plasmide parental. J'ai également fait une ligation avec un insert et un vecteur déjà utilisés pour un autre clonage qui lui avait fonctionné, pour avoir un contrôle de ligation. J'inactive mes enzymes après digestion et ma ligase avant ma transfo. J'ai également testé plusieurs quantités d'ADN pour ma ligation (50, 100 et 300 ng) et mes boîtes restent vierges de colonies.
J'ai également tenté d'insérer ma séquence codante dans un autre plasmide d'expression : là je digère mes deux plasmides (le vecteur vide et mon plasmide "parental") avec EcoRI et XbaI et j'ai testé les rapports 1:3 et 1:9. Lorsque je fais migrer mes produits de ligation, je ne vois plus mon vecteur vide mais des bandes qui pourraient correspondre à mon plasmide avec insert surenroulé et non surenroulé, ainsi que des concaténaires d'insert. Et là encore, je n'ai pas de colonie.
Je me demande donc si tu as trouvé la solution à ton problème ou si quelqu'un avait une idée pour résoudre le mien.

Merci d'avance à tous ceux qui me répondront

[invite26ec59f9]

malheureusement je n ai pas trouve de solution a mon probleme. J ai change de vecteur de destination en utilisant un pUC19 a la place du pEGFP, j ai change d enzymes en utilisant Xba1 et Ecor1... et RIEN, le neant. Donc vu que j en avais marre d y passer tt mon temps, j ai commence d autres manips en parallele, et je retenterai le coup d ici un mois.. les lois de la bio mol sont parfois impenetrables Mon ancien boss me disait toujours : avec la bio mol des fois il faut pas chercher a comprendre, si tu as constate qu en faisant trois fois le tour de l arbre qu il ya ds la cour avant de faire tes clonages ceux ci marchent, fais a chaque fois les trois tours de l arbre... meme si tu comprends pas pquoi. J ai plus d arbre ici, alors j attends que je ne sais trop quoi se produise qui fera que ma manip va finir par marcher...
Bonne chance