Bonjour a toutes et a tous,
je place bcp d espoir dans ce forum car malheureusement jusqu a aujourd hui je n ai pu trouver de solution a mon probleme qui est le suivant :
Je desire sous-cloner un fragment de clone moleculaire HTLV dans pUC19 afin de pouvoir proceder a une mutagenese dirigee sur ce fragment pour ensuite le reintroduire ds le clone moleculaire.
J ai donc extrait ma sequence d interet en digerant mon clone moleculaire par Sal1 et EcoR1. Mon insert a une taille de 3200kb, bien visible sur gel d agarose. D ailleurs je purifie celui ci a partir du gel par un systeme de colonne Qiagen classique. En parallele, je digere mon pUC19 (2600kb) par les memes enzymes et le purifie de la meme maniere (j ai egalement fais cette approche sur peGFP-N1 qui contient lui aussi Sal1 et Ecor1). Je procede ensuite a la ligation dans 20 microl avec un rapport 1/1 et 1/3 en vecteur/insert. J utilise la DNA ligase O/N a 16 degres. Je transforme 5microl et 15 microl de ma ligation ds des TOP10 chimiquement competentes.. apres plus d un mois d essai, je n ai tjs rien sur mes boites, et la je suis prete a aller poser qques cierges pour Ste Rita, patronne des causes deseperees.
J ai verifie les antibio, les bacteries, dephosphoryle ou pas mon vecteur, change ma ligase, changer de vecteur, rien n y fait... je n ai malheureusemnt pas d electroporateur a ma dispo, dc je dois rester sur des bacteries chimiocompetentes.
Pour la premiere fois j'utilise des enzymes de restrictions de chez Fermentas, et je me demande si, meme si je n ai jamais du le faire avant avec les enzymes NEB, je devrais inactiver mes enzymes ?
Mon insert est il trop gros par rapport a mon vecteur? Devrais je essayer d autres rapports insert vecteur, sachant que l insert est plus grand que mon vecteur?
Qquun a t il deja eu des soucis avec des digests Sal1-EcoR1?
J attends vos suggestions avec impatience car j ai l impression d avoir tout verifie.. en plus j ai deja reussi des clonages bcp plus compliques que ca.. comme quoi en bio mol, ce qu on croit etre "simple" ne l est pas toujours, loin de la...
merci par avance et bonen chance dans vos manips !!
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