Bonjour!
J'aimerais savoir comment faire pour choisir les amorces en PCR.
je sais qu'il y a 2 amorces qui s'hybrident sur la séquence (une sur le brin sens l'autre sur le brin antisens) mais lorsque on me donne une longue seq d'un gene (500 bases) je ne sais pas où je dois regarder pour placer les amorces ni comment faire pour connaitre la seq des amorces.
merci.
Bonsoir,
Ya pas mal de paramètres à contrôler pour designer des primers, je vais en mettre quelques-uns, mais je risque fort d'en oublier aussi, alors j'espère que quelqu'un va me les compléter ^^
Tout d'abord, il faut voir ce que tu veux finalement faire avec ton amplicon.
Si c'est juste pour du génotypage, tu peux prendre n'importes quelles séquences de ton gène pour avoir de l'amplification spécifique.
-Il faut juste faire attention à bien avoir un primer sens et un primer anti-sens, et que ton primer sens soit en amont de ton primer anti-sens sur la séquence qu'on te donne.
-A noter qu'un primer et toujours noté dans le sens 5'-3', donc, pour écrire ton primer anti-sens, il faudra non seulement faire les inversions nécessaire par rapport à la séquence qu'on te donne (A en T, C en G et inversement) mais aussi l'écrire en sens inverse (pour bien avoir le sens 5'-3').
-même si on peux avoir une hybridation spécifique avec bien moins de nucléotides, on utilise généralement des primers de plus de 18 nt.
-Les primers se termine généralement par un G ou un C
-avoir une melting temperature de 52-58°C, ya plein de site de bio-info qui te donne cette melting temperature si tu leur donne la séquence de ton primer
-la composition de ton primer en C et G devrait être entre 40 et 60 %
-Eviter que ton primer ne puisse former des structure en épingle ou créer des dimers
Maintenant, si tu veux faire du clonage, ou quoi que ce soit pour avoir une protéine native, ya encore d'autre trucs à rajouter:
-ton brin sens doit comporter le codon d'initiation
-ton brin anti-sens doit comporter le codon stop
-placer la séquence KOZAC (ou shine-Dalgarno, selon le cas) en amont du codon d'initiation, pour une bonne expression dans des bactéries
J'espère que j'ai rien oublié, et que je me suis pas trop trompé, mais sinon, ya toujours ça:
http://www.premierbiosoft.com/tech_n...er_Design.html
Cordialement,
Astro
La science ne sert guère qu'à nous donner une idée de l'étendue de notre ignorance.
Si c'est pour de l'identification, il faut que la séquence des tes amorces soient spécifiques. Mais c'est vraisemblablement pas le cas ici, vu que t'as qu'une séquence.
C'est une question purement théorique (exo) ou pratique ? Suivant le cas, la réponse sera aussi pas forcément la même, car la théorie permet de s'épargner les quelques contraintes qu'a cité astroBax, suivant l'énoncé.
Re : amorces PCR
Bonjour
merci beaucoup pour vos réponses je vais donc pouvoir résoudre mon exo.
A ta place, je m'inspirerais quand même un peu des connaissances dans tes cours ainsi que des contraintes de l'exercice.
Si tu utilises des connaissances qui ne tiennent pas compte des paramètres de l'exercice, c'est bien, mais ton prof peut considérer que c'est faux.
