Marquage à l'iodure de propidium pour suivi du cycle cellulaire

[invite069c8204]

Bonjour,

Je voudrais réaliser des expériences de cycle cellulaire, mais il existe trop de protocoles différents ! J'ai vraiment besoin d'aide, mais surtout d'éclaircissements !

Si j'ai bien compris le principe de cette méthode, la perméabilisation des cellules entraîne la sortie des fragments d'ADN de 180 bp, ce qui fait que l'intensité de fluorescence des cellules en apoptose est inférieure à celle des autres cellules (puisque proportionnelle à la quantité d'ADN), d'où l'apparition d'un pic en subG1

- Pour commencer, de quelle façon la fixation à l'éthanol 70% permet-elle de perméabiliser les cellules ?
- Quel est l'intérêt d'utiliser un tampon phosphate/acide citrique (dans certains protocoles) ?
- J'ai déjà fait un test avec la drogue qui m'intéresse, sachant qu'à la dose max que j'utilise, à t=24h, en TMRM j'ai 100% d'apoptose, mais en PI j'ai 30% uniquement. Je me doute bien qu'on doit observer moins de cellules apoptotiques dans le cas du marquage au PI (même si je ne sais pas trop pourquoi), mais de là à avoir une si grande différence, je pense que mon protocole n'est pas au point !

Voici mon protocole : à t=24h (sur cellules en suspension)
- centrifuger, jeter le surnageant
- laver au PBS
- fixer à l'EtOH 70%
- incuber 2h à 4°C
- centrifuger, jeter le surnageant
- ajouter la solution de marquage (PI 25µg/mL, EGTA 2 mM, RNase A 10 µg/mL, digitonine 50 nM)
- incuber 30' à température ambiante à l'obscurité

Voilà, j'espère que vous pourrez éclairer ma lanterne car je commence vraiment à désespérer de réussir à mettre un protocole au point !!!

Merci d'avance
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[invite71f23525]

Non c'est tout à fait normal que deux résultats de mort cellulaire obtenus avec deux méthodes différentes ne donnent pas les mêmes proportions de mort. Je ne connais pas la méthode de TMRM. En revanche j'ai déjà fait bleu trypan et marquage IP en parallèle et je peux t'assurer qu'en bleu trypan le pourcentage de mort était de l'ordre de 60% alors qu'en marquage IP la fraction de cellules en subG1 était de 15-20%. En mort cellulaire basale (sans traitement), j'ai 10% avec le bleu trypan, presque 0% avec IP.

Le fait est que les deux méthodes ne quantifient pas la mort cellulaire de la même manière et que de nombreux biais peuvent s'y ajouter. Pour le bleu trypan par exemple, deux explications majeures s'affrontent ou se complètent. La première dit que les cellules sont colorées à cause d'une forte perturbation de l'intégrité de leur membrane qui devient perméable au bleu trypan. La deuxième dit que le potentiel ATPasique tend vers 0. De ce fait tous les transports actifs qui consomment de l'ATP et permettent l'efflux de xénobiotiques comme le bleu trypan sont inefficaces, d'où la coloration des cellules. On peut donc penser que le bleu trypan peut colorer les cellules en apoptose, en nécrose, perméabilisées (mais pas forcément mortes) et éventuellement en autophagie (si celle-ci évolue vers une mort cellulaire). On a donc plutôt une sur-évaluation de la mort cellulaire avec cette technique puisque des cellules endommagées mais pas forcément mortes seront comptabilisées comme mortes.

Pour le marquage IP, comme tu l'as dit, les cellules en subG1 le sont surtout à cause d'une fuite des fragments d'ADN clivés hors de la cellule. Seulement, le clivage régulier de l'ADN internucléosomal est typique d'un processus apoptotique. Dans le cas des autres morts cellulaires, la dégradation de l'ADN peut intervenir plus tardivement dans le cas d'une mort cellulaire par autophagie et/ou est plus anarchique comme dans le cas d'une nécrose. D'autre part, la nécrose a une forte tendance à générer par la suite des débris cellulaires qui ne seront pas comptabiliser en cytométrie si la nécrose est trop avancée. Donc le FACS est plus fin dans sa comptabilisation de la mort cellulaire, plus sélectif et c'est certainement la raison pour laquelle on a une sous-évaluation de la population de cellules mortes totales.

Cela permettrait d'expliquer pourquoi on obtient de telles différences entre deux techniques de quantification de mort cellulaire.