détection de gènes multicopies

[invite662eeae6]

Bonjour,
d'après de premières analyses il semblerait que mon gène soit multicopie et je voudrai le confirmer par une technique de BM.
Tout d'abord j'avais penser faire une digestion de mon adn, puis faire migrer, suivi d'une hybridation avec une sonde radioactive et j'aurais alors pu voir si une ou plusieurs bandes "s'allumaient". Malheureusement cette technique nécessite une grande quantité d'adn que je n'ai pas.
Donc connaissez-vous d'autres techniques?
Pensez-vous qu'une sonde froide + visualisation en épifluorescence soit possible?
Merci
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[noir_ecaille]

Amplifier par PCR je crois ?...

[invite662eeae6]

mais je ne vois pas comment une amplification PCR me montrerait si mon gène est présent en 1, 2 ou 3 copie dans le génome??

[Edelweiss68]

Pensez-vous qu'une sonde froide + visualisation en épifluorescence soit possible?

On peut faire de la FISH mais la PCR est possible aussi à condition qu'elle soit quantitative. Mieux vaut attendre confirmation de cela...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite02e16773]

La seule expérience que j'ai de la PCRq est théorique (+ quelques TP et aperçus en labo), mais à ma connaissance elle permet bien de détecter si un gène est présent en une ou plusieurs copies.

Par contre, la PCRq n'est pas une preuve absolue. Pour en avoir le coeur net il vaut mieux passer au southern... Ou au séquençage si ça vaut le coût.

[Flyingbike]

en PCRq c'est possible, la difficulté étant de savoir a quelle quantité de référence se rapporter. Par contre en FISH je vois pas comment on peut faire .
La méthode de référence, celle utilisée par exemple lorsqu'on veut déterminer le nombre de copies qu'on a inséré lors de la réalisation de souris transgéniques, c'est en effet le southern blot.

[Edelweiss68]

Par contre en FISH je vois pas comment on peut faire .

Ben par exemple ici, à la diapo 9 : http://docs.google.com/viewer?a=v&q=...BSLVyk2DeIlyAw

On peut aussi en CGH array non ? Après, ce n'est peut-être pas adapté à cette situation...

[Flyingbike]

Ouais effectivement mais c'est pas très clair. Si tu as compris je veux bien une explication

[Edelweiss68]

Ouais effectivement mais c'est pas très clair. Si tu as compris je veux bien une explication

Pour la FISH ou la CGH ?

[Flyingbike]

POur le FISH. J'ai du mal a comprendre comment cette technique peut a coup sur te donner le nombre de copies d'une séquence X ou Y présentes dans le génome.
Merci d'avance

[Edelweiss68]

POur le FISH. J'ai du mal a comprendre comment cette technique peut a coup sur te donner le nombre de copies d'une séquence X ou Y présentes dans le génome.
Merci d'avance

Oulala à coup sûr, je ne m'avancerais pas à dire ça ! Déjà parce que ça se saurait et vu la doc qu'il y a dessus sur internet, ça n'a pas vraiment l'air très employé. J'imagine que le coût y est pour quelque chose puisqu'il faut à chaque fois la sonde qui va bien. Et je pense aussi que la technique ne marche pas pour un trop grand nombre de copies ou la présence de copies trop rapprochées puisque la résolution de la technique n'est pas au nucléotide près.
Je n'ai eu qu'un pauvre petit cours théorique sur la FISH alors pour le côté pratique, je spécule un peu.
Mais il me semble bien que c'est une technique de référence pour la confirmation de certaines maladies liés à une augmentation du nombre de copies d'un gène.

Pour le principe de la FISH interphasique et bien déjà on peut la faire sur n'importe quel tissu. On dénature la lame avec le matériel génétique et les sondes puis il y a hybridation des sondes spécifiques du gène en question (locus spécifique) sur l'ADN simple brin (en parallèle on contrôle les conditions dénaturantes et la température). On peut détecter les sondes soit directement si elles sont fluorescentes soit par IF si elles ont été marquées.

Je ne sais pas si c'est vraiment ça que tu voulais savoir ...?

[TanguyE]

Bonjour,

La FISH est utilisée en cytogénétique moléculaire notamment pour repérer les translocations ou les duplications sur les chromosomes.

Pour les détails, j'ai regardé vite fait ce doc, il m'a l'air plutôt bien fait: http://www.springerlink.com/content/b02wt53g952978q4/

[invite02e16773]

Pour la FISH, il me semble qu'il faut un minimum de 25 molécules fluorescentes par sonde pour les repérer en microscopie.
Donc si la sonde est trop petite (i.e. si la séquence d'intérêt à identifier est trop courte), ça peut bloquer...

Et a ma connaissance aussi (uniquement théorique) c'est vraiment pas super résolutif.