Faux positif en mutagénèse dirigé

[invitef0543e9e]

Bonjour,

j'ai des problèmes avec mes mutagenèses dirigés.
Je réalise une mutagènese sur un plasmide plenti afin de modifié 3 bases qui ont 1 à 2 bases d'écart en 1 mutagénèse. Après transformation j'ai plein de colonies. Problème en les séquençant mes mutations n'ont pas disparu!!!!

J'utilise le kit lightning de stratagène et je digère 6 minutes avec dpn1
.
Quel paramètre dois je changer pour que cela marche enfin?

Je peux augmenter la température d'élongation à 72°C au lieu de 68°C? quoi d'autres?
(digéré plus longtemps par dpn1?ou quantité plus élevé? pour d'autres mutagenese sur le même plasmide cela a très bien marché avec les conditions standart)

Merci de vos réponses
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[Yoyo]

Salut

Si tu n'as pas inséré tes mutations c'est que le plasmide que tu séquences est la matrice!
Ce qui implique que ta digestion a la dpnI n'a pas été assez efficace! As tu fait ton controle sans mutagenese pour vérifier cela?

Personnellement je digère entre 1h à 2h à la dpnI.

YOyo

[invitef0543e9e]

Bonjour,
merci de ta réponse.
tu digere 1 à 2h même avec le kit ligtning? (5min dans le protocole)

[invite1260514a]

Bonsoir,
Combien fait ton insert? pour les 5 min je fais pareil et c'est ok
Sinon est ce que ton enzyme est pas trop vieille ou a pas trop trainé sur la paillasse ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef0543e9e]

Bonjour,
le plasmide + insert = 11.5kb insert 4.4kb. J'ai deja réalisé d'autres muta sur ce plasmide est aucun problème.
Cette fois ci j'ai digéré 10min et 1heure, j'ai des colonies je vais voir demain si cela a marché. (le kit est quelques semaines et il fonctionne)
Je vous donnerai la reponse demain!
merci de vos réponses

[invite1260514a]

Bonsoir,

4.4kb c'est grossomodo ce que l'on avait et la mutagenèse n'a pas voulu fonctionner alors que pour une autre protéine de 2.2kb ça a très bien fonctionné

[Yoyo]

salut

j'utilise le kit quickchange de stratagene, qui d'apres ce que j'ai vu est la meme chose que celui d'agillent.
De mon point de vue 5min de digestion c'est trop court! Tu ne risques rien a tenter plus longtemps.

YOyo