[histologie] Inclusion pour coupe histologique

[kinette]

Bonjour,
Nous avons actuellement un petit souci pour réaliser des cupes histo d'organes d'insectes.
Comme on a affaire à de toutes petites structures molles et fragiles, la technique est de les inclure d'abord dans de l'agar (supplémenté en formaldéhyde), puis de passer le tout dans des bains successifs de plus en plus concentrée en éthanol (1 heure à 70%, 1h à 80 et une à 100%) avant de passer au phénol, pour ensuite inclure dans la paraffine.
Le problème qu'on a se pose en fait avec l'agar, qui s'effondre complètement lorsqu'on passe de l'éthanol au phénol, sans qu'on comprenne pourquoi.
On se demande si c'est qu'on n'a pas assez déshydraté notre bloc, ou si l'agar serait dégradé...

Est-ce que quelqu'un connaîtrait ce genre de problème, ou aurait un protocole "béton" pour de telles inclusions?

Merci d'avance,

K.
-----

[piwi]

salut,

Pour l'histologie c'est assez simple mais faut avoir les bons protocoles ou l'experience.
Essayez d'oublier l'agar avant l'inclusion. L'agar sert pour les coupes vibratome mais pas vraiment pour proteger un tissu pendant l'inclusion.

Avant de faire quoi que ce soit il faut fixer tes tissus (sauf contre indication particulière mais en principe dans 99% des manip' c'est mieux)
Tu peux fixer paraformaldehyde 4% à 4°C pendant 30-1h. Pour de petits organes comme ca c'est tres rapide. Tu peux aussi tenter la formaline ou le boin. Là tu fixerait à temperature ambiente pendant quelques heures (c'est un peu plus lent). L'interet d'une telle fixation est que ca va te preserver tes structures en les durcissant.

Une fois que c'est fixé je te conseille de laver tout cas dans un peu de PBS ou equivalent histoire de pas trainer le fixateur trop longtemps, vu que c'est toxique pas la peine de le conserver.

Une fois que tu en es là il faut effectivement deshydrater. EtOH 70° 1/2h, EtOH 90° 1/2h, et 2x100 1/2h. (tu adaptes en fonction de la taille des organes mais si c'est vraiment petit ca devrait suffire)
Ceci fait il faut passer dans un milieu intermediaire entre les solution alcooliques et resine. Le phénol doit être le pire.... preferez histosol ou histolemon (l'odeur de citron ne doit pas masquer le coté toxique de la chose) 2x 1/2h

Normalement avec ca vous devriez couper proprement et en tout cas mieux qu'avec l'agar.

[kinette]

Merci Piwi pour tes conseils!
Enfin nos organes sont vraiment tout tout petits (on s'intéresse à des testicules d'insectes qui font à peine un millimètre de long, c'est pour dire!
Donc c'est un peu costaud à manipuler, d'où l'utilisation du fameux agar... ceci dit, on peut tenter de faire autrement, on va réfléchir.

K.

[piwi]

1 mm de long avec une bonne fixation qui l'a rigidifé et une bonne pincette (type dumont dumostar) tu peux le manipuler c'est pas un enorme souci.
Je pense vraiment que l'agar vous apportera plus de soucis que d'aide en fait.

[A voir en vidéo sur Futura]

[kinette]

1 mm de long avec une bonne fixation qui l'a rigidifé et une bonne pincette (type dumont dumostar) tu peux le manipuler c'est pas un enorme souci.
Je pense vraiment que l'agar vous apportera plus de soucis que d'aide en fait.

Hello,
On va essayer avec l'insecte entier (1mm de long). Par contre pour les testicules, c'est vraiment trop petit et fragile pour être manipulé (le passage d'un bain à l'autre est catastrophique).

K.

[piwi]

si les testicules posent problème pourquoi les prelever apres tout.
Finalement un insecte est quelque chose de petit. Tu pourrais parfaitement songer à l'inclure entier (sans les ailes peut etre, de toute facon elles ne t'interessent pas si j'ai bien compris) et l'orienter sous le microtome de facon a avoir les coupes de testicules que tu souhaites.

Dans le fond, si on preveleve les organes c'est parce c'est possible et que l'on ne peut pas mettre sous le microtome une souris en entier. Sinon on fixerait toute la souris et on couperait tout en place

Tu peux faire des essais en conservant la mouche ou seulement l'abdomen.

Enfin je ne sais pas... Mais moi je tenterais quelque chose comme ca. (l'essai doit à tout prendre te faire perdre 1h ou 2 avant d'inclure et tenter de couper.)

[invite1bdb35ca]

salut j'aimerai bien savoir la methode exacte de la coupe histologique je veux dire les differentes etapes

Un remerciement n'aurait pas été de trop non? Charte

LXR