Bonjour,
Je viens de commencer en thèse et j'ai besoin de conseils relatifs à la synthèse et au marquage radioactif d'un ARN. Je suis confrontée à deux types de problèmes: le premier, j'ai un très faible rendement lorsque je transcrit cet ARN (0,6 ou 0,8µl/µg max). Je fais ma transcription en 3h à 37°C avec un premier apport d' enzyme T7 au debut de la manip puis un second apport après 1h30 (du à l'instabilité de l'enzyme à cette température).
Je dois préciser que cet ARN est tres long et très structuré: 514 nucléotides et 14 tiges boucles.. Je le purifie sur gel acryl/bisacryl 5% après transcription. J'ai lu plusieurs fois que pour de si longs ARN, une purification sur colonne HPLC était mieux niveau rendement, par contre, il n'est pas vraiment possible de séparer les produits de transcription abortive ou les dégradations.. Qu'en pensez vous?
Là vient mon second problème: une fois transcrit, je procède à une déphosphorylation avant de marquer mon ARN radioactivement. En faisant un gel controle apres déphosphorylation, j'observe que ma bande ARN est relativement propre mais une fois l'ARN marqué et les premieres manips (EMSA) effectuées, je n'obtiens aucun résultat et je me rends compte que mon ARN est tres dégradé. Quelqu'un aurait -il un conseil à me donner pour éviter cela?
Merci bien
Delph.
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