Fabrication Solution CTAB

[invited63638d3]

Bonjour,
je suis en stage dans un labo de recherche et je dois réaliser une solution de lyse CTAB afin d'extraire l'ADN de Fusarium langsethiae, et Geotrichum candidum. Le problème est que je n'ai aucun protocole pour réaliser cette solution de CTAB mis à part qu'elle se compose de CTAB(1ou2%), EDTA(20mM),NaCl(1,4M) et Tris-HCl(100mM). Pour un volume donné, je mélange les réactifs dans de l'eau milliQ...Mais je n'extrait aucun ADN... J'ai déjà testé tous les autres réactifs qui pouvaient potentiellement être la cause de mon pb, mais sans résultats. J'en ai donc déduit que cela venait de mon CTAB. Quelqu'un a-t-il un protocole précis pour réaliser cette solution ?? (Le matériel de départ est un aliquot de culture de F.langsethiae et/ou G.candidum, et la biomasse récoltée est broyée à l'azote liquide avant lyse dans le CTAB).

Merci pour votre aide
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[Flyingbike]

Est-ce que le tissu est bien lysé dans le tampon ? Est-ce que le Tris n'est pas trop acide ? Comment vérifies tu la présence ou non d'ADN ?

[invited63638d3]

Le Tris-HCl est à pH = 8.
Je lyse dans le CTAB (après avoir broyé à l'azote liquide)en incubant à 50°C pendant 10min puis 1h à 4°C. Ensuite j'ajoute du phénol:chloroforme et j'obtiens 3 phases. Je garde la phase supérieure où sont les acides nucléiques. Je précipite ensuite à l'éthanol absolu, et à froid. Et là je vois que je n'obtiens pas de "pelotte d'ADN". Une fois mon extraction terminée je dose au spectro et j'obtiens des quantités ridicules du genre 12µg/mL...Je pense donc que mon pb vient du fait que la lyse ne se fait pas correctement, donc je dois avoir un pb avec mon tampon CTAB (ce qui est fort probable puisque je n'ai pas de protocole précis pour le réaliser) mais je ne vois pas comment résoudre mon pb...

[Flyingbike]

Si tes cellules restent entières, ca peut expliquer que tu n'aies pas d'ADN. Le phénol utilisé est il adapté à l'ADN ? Il existe plusieurs phénols/chloroformes de pH variés.
Y a-t-il une agitation suffisante apres ajout du phénol ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited63638d3]

J'utilise du phénol:chloroforme 5:1 de Sigma, adapté pour la biologie moléculaire. Il a été utilisé l'an dernier au cours d'un autre stage pour justement extraire l'ADNg des mêmes organismes.
Après avoir mis le phénol, j'agite par retournement jusqu'à ce que les deux phases se soient bien mélangées, mais je ne sais pas du tout s'il faut mélanger encore longtemps après ou non...

[invite7825c20b]

Vérifie bien tes concentrations en NaCl dans tes extractions c'est important dans ces protocoles

[Flyingbike]

Il faut surtout bien agiter dans le phénol sinon ton adn ne passe pas en phase. Tu peux faire un contrôle en essayant de précipiter l'ADN directement après la lyse dans le CTAB (apres clarification éventuellement) en ajoutant un volume d'isopropanol et en agitant bien. Si tu vois de l'ADN à ce moment la, tu sauras que ca vient de l'extraction phénol.

[invite7825c20b]

En fait je comprend pas très bien ton protocole. L'avantage du ctab c'est que c'est un détergeant qui se lie à l'ADN. On s'en sert pour précipiter l'ADN de manière complexé au CTAB. Et tu sais fais ça en abaissant ta concentration saline. Après tu redissous ton culot DNA+CTAB en augmentant la concentration en sel et là tu précipite spécifiquement l'ADN. Dans ce que tu décris tu ne fais qu'une étape de précipitation, moi j'ai jamais fait comme ça.

[invite2e21fee6]

J'ai utilisé la méthode du CTAB pour des plantes principalements et l'incubation se faisait 1h à 65°C... Peut être que celle-ci est trop faible... Sinon, en fonction vu matériel utilisé, l'ADN n'est parfois présent que sous forme d'une mini goutte translucide... Le mieux est de doser l'ADN au spectro pour être certain de la quantité extraite. (Sinon vérifie les pH car je sais qu'un mauvais pH peut changer la répartition des acides nucléiques en phase aqueuse... Je ne connais pas les valeurs, il vaut mieux vérifier.

[invite03930724]

Bonjour,

je relance le sujet car je suis stagiaire en M2 et j'ai du préparer du tampon CTAB pour extraire de l'ADN d'invertébrés marins.

J'avais simplement les concentrations finales du tampon, sans protocole à suivre donc j'ai quelques doutes :
Tris HCl pH 8 100mM
EDTA pH 8 20mM
NaCl 1.4M
CTAB 2%
Eau distillée

J'ai ajusté le pH à 8 hier soir après avoir mis tous les constituants dans environ 300mL d'eau, mais j'ai du attendre ce matin que tout soit bien dissous.

Je voulais donc savoir si le pH final devait être à 8 ? ou si ce sont les solutions de Tric Hcl et d'EDTA qui devaient avoir un pH de 8 ?

Merci d'avance

[Flyingbike]

en principe, c'est le Tris qui "décide" du pH de la solution*, c'est d'ailleurs pour ça qu'il est là. Idéalement, le pH de la solution finale ne devrait pas être éloigné de 8. Vous pouvez le vérifier.



*dans la mesure où elle ne contient pas d'autre composé pouvant modifier le pH, comme ici.