Principe et manipulations générales pour le test ELISA indirect

[invite6e97b3dd]

Bonjour à tous, moi et mon équipe de classe devons réaliser un protocole ELISA indirect à partir d'un article en anglais que le prof nous a fourni et la matière sur cette technique n'a pas encore été vu en classe. Je comprends bien le principe de base du test ELISA mais mon questionnement est davantage d'aspect pratique.....
Premièrement, j'ajoute que nous avons 2 types d'anticorps, « Goat profilin polyclonal antibody » et « rabbit anti-goat IgG alkaline phosphatase conjugated », le tampon de lavage est du PBST et celui pour sceller les puits (to block?) est du 5% BSA dans du TBST et le substrat du pNPP. Si j'ai bien compris, le but est de doser de la profiline (correspondant à l'antigène ici) par l'intermédiaire d'un des Ac.

À quoi cela sert-il de trouver une concentration optimal pour les anticorps? Serait-ce pour l'intervalle d'efficacité de la lecture d'absorbance?

Comment procède-t-on pour réaliser une courbe standard? Utilise-t-on une concentration connue de profiline avec différentes dilutions d'anticorps?

Et pour le test en général, faudra-t-il préparer un puits sur la microplaque pour chaque concentration de chaque Ac? À ce moment, comment savoir laquelle des valeurs sera la bonne???

Bon... c'est peut-être beaucoup de questions, mais ma journée de recherche à la bibliothèque n'a pas porter fruits...

Merci beaucoup à ceux qui m'aideront à m'orienter dans cette nouvelle technique pour moi!
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[Edelweiss68]

Bonjour,

et celui pour sceller les puits (to block?) est du 5% BSA dans du TBST

Le BSA est un tampon permettant de "bloquer" les sites non spécifiques et d'empêcher donc les fixations non spécifiques.

À quoi cela sert-il de trouver une concentration optimal pour les anticorps? Serait-ce pour l'intervalle d'efficacité de la lecture d'absorbance?

Vous ne connaissez pas votre concentration d'antigène (Ag) puisque vous en faites justement le dosage donc il vous faut trouver la concentration d'anticorps (Ac) pour laquelle vous ne serez pas en excès d'Ag ce qui pourrait empêcher la lecture du signal par effet dit "crochet" ou "de zone" correspondant à un même signal pour deux concentrations différentes.

Comment procède-t-on pour réaliser une courbe standard? Utilise-t-on une concentration connue de profiline avec différentes dilutions d'anticorps?

Vous utilisez en effet différentes concentrations connues de votre Ag et la concentration adaptée d'Ac afin de ne pas être en excès d'Ag (je ne pense pas qu'il faille nécessairement faire plusieurs dilutions d'Ac puisque vous connaissez votre concentration d'Ag dans ce cas).

Et pour le test en général, faudra-t-il préparer un puits sur la microplaque pour chaque concentration de chaque Ac? À ce moment, comment savoir laquelle des valeurs sera la bonne???

Vous verrez l'allure de la courbe obtenue pour les différentes dilutions d'Ag. Si c'est une forme de cloche, il s'agit de l'effet crochet.

Avez-vous l'article en question ? Pour voir si je ne vous ai pas dit de bêtises...