Test elisa

[invite6d4a7508]

Bonjour à tous. je me permet de créer ce poste parce que je galère un peu sur la notion de titre pour une solution d'anticorps. rien de bien grave me direz vous, et pourtant.
j'ai effectué un test Elisa dont le but était de déterminer le titre de deux solutions d'anticorps primaire. Je sais que le titre correspond a la dilution permettant d'obtenir 50% du signal maximum.
Voilà donc ma question.
je ne voit pas, si l'on sort du contexte du test Elisa, pourquoi il faut diluer une solution d'anticorps. Je comprend que si la solution d'AC et trop peu concentrer tous les AG ne seront pas détectés mais en cas d'excès? En effet si l'anticorps est en forte concentration par rapport a l'antigène le surplus est logiquement enlever par les étape de saturation et/ou de lavage au détergent. En résumé je comprend que la dilution ne doit pas être trop faible pour ne pas perdre d'information, mais je ne comprend pas pourquoi il ne faut pas une dilution trop grande.
merci d'avance et désolé pour l'orthographe.
-----

[invite4ff9937a]

Salut,

Si on sort du contexte de l'ELISA ou tu dois diluer pour trouver le titre les raisons pour lesquelles on dilue au maximum les anticorps sont: 1)limiter le bruit de fond. Plus ta solution est concentré en Ac plus ils risquent de se fixer un peu n'importe où et donc tu auras du bruit de fond. La deuxième est que c'est souvent assez cher à produire et à acheter donc plus tu dilus plus tu économises ta solutions d'anticorps de détection....La deuxièmes raisons n'est pas évidente pour les étudiants mais dès que tu arrives en labo et que tu achétes des Ac 700 ou 800 euros le tubes tu te rends compte vite que tu as intérêt à les utiliser le plus diluer possible

cordialement

[invite6d4a7508]

merci pour ta réponse aussi rapide.
donc si j'ai bien compris, si on part sur une experience de type westerne blot par exemple, l'interêt du titre est donc de de limiter le bruit de fond (ac non spécifiquement liés) et d'économiser des ac. Ok . dans ce cas j'ai une seconde question. si j'utilise dans un western une solution d'ac et que je la dilue au titre donner par le fournisseur cela signifie que tout mes AC ne se fixeront pas sur tout mes AG si je n'obtient que 50% du signal maximum. Est-ce suffisant? cela peut aussi poser problème si je fais un autre test elisa dans le but et de doser un antigène puisque si ma concentration en antigène et très forte la quantité d'ac sera inférieur a la quantité d'AG. quel est la solution dans ce cas? on procède a des dilutions de l'échantillon d'antigène?
Merci d'avance

[invite4ff9937a]

Salut

Pour moi la définition du titre d'un Ac c'est: l'inverse de la dernière dilution donnant un signale positif...
Concrètement la quantité minimum d'Ac dont on pourra détecter un signale si l'anticorp est présent =donc fixer à son Ag.

Donc deux cas possibles. 1) La quantité d'Ag est supérieur ou égale à la quantité d'Ac minimal pour avoir un signal positif (son titre). Dans ce cas la on à un signal positif.
2) la quantité d'Ag est inférieur à la quantité d'Ac minimal pour avoir un signal positif. Dans ce cas on ne détecte pas l'Ag.

la question est de savoir à partir de quand l'expérimentateur décide que la quantité d'Ag est négligeable.

Par exemple pour un titre élevé ex 10000éme (donc un quantité d'Ac faible est suffisante pour détecter un signal) si on ne détecte pas de signal on peux avoir confiance dans le résulat car on sais que même avec une petite quantité d'Ag on aurai détecté quelque chose. Biensûr on peux toujours se dire que il y'à quand même de l'Ag présent mais trop faiblement pour le détecter.
Dans ce cas la on est en dessous du seuil de sensibilité c'est une limite on y peux rien. La seul chose qu'on peux se dire c'est que même si il y'a de l'antigène il est en très faible quantité (puisque on avait un Ac de titre élevé) donc c'est à l'expérimentateur de décider si cette quantité très petite (si elle est présente) peut-être considéré comme non significative.

je ne sais pas si j'ai répondu précisément à ta question et même si tu comprendras ma réponse. N'hésite pas à me le dire.

Cordialement

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6d4a7508]

oui je pense que tu as répondus au moins en partie à ma question. Pour les expérience de type western pas de soucis l'important et d'avoir un signal donc on se fiche que les antigenes soit partiellement ou tous marquer. Mais dans une expérience quantitative comme le test elisa ( dans le cas ou on cherche a doser un AG) et que la quantité d'AG est supérieur à la quantité d'AC, on est bien embêté puisque si on prend une dilution moins grande que le titre pour comblé cette différence on risque de ce retrouver dans les limite de beer lambert lors de la lecture. Dans ce cas qu'est ce qu'on fait? on fait une gamme de dilution de notre solution d'AG pour ne pas touché au titre de l'AC?

cordialement