bleu de Laemmli... jaune

[invitebef535e4]

Bonjour,

je fais actuellement beaucoup de Westerns Blots dans mon laboratoire. Depuis quelques mois, le bleu de Laemmli que nous utilisons pour préparer nos échantillon vire inmanquablement au jaune, après être passé par toutes les teintes imaginables de vert, rouge et orange. Une fois mélangé aux protéines et déposés dans les puits, il redevient tout de même bleu.
Quelqu'un a-t-il déjà été confronté à ce phénomène ? Peut-il m'expliquer de quoi il s'agit et si le bleu de Laemmli est quand même utilisable ?

Merci d'avance.
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[Flyingbike]

il faut vérifier le pH du tris qui sert a préparer le tampon. C'est fait maison ?

[LXR]

Il y a autre chose, quand on prépare le tampon de charge il faut mettre la bonne quantité de bleu de bromophénol (poudre orange) : pas assez et on obtient un bleu clair pas pratique pour le dépôt, trop de poudre et la couleur vire au jaune. Tu n'as pas eu un problème d'évaporation de ton tampon de charge qui aurait concentré le bleu de bromophénol?

[Flyingbike]

Regarde le wikipedia sur le bleu de bromophenol, il est jaune sous forme acide et vert sous forme basique. Si ton tampon n'est pas au bon pH, cela peut avoir des conséquences sur les protéines.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitebef535e4]

Merci pour toutes vos réponses.

Il y a autre chose, quand on prépare le tampon de charge il faut mettre la bonne quantité de bleu de bromophénol (poudre orange) : pas assez et on obtient un bleu clair pas pratique pour le dépôt, trop de poudre et la couleur vire au jaune. Tu n'as pas eu un problème d'évaporation de ton tampon de charge qui aurait concentré le bleu de bromophénol?

Le bleu est conservé dans des tubes falcon classiques bien fermés, je ne pense pas que le problème vienne d'une évaporation du tampon de charge.

il faut vérifier le pH du tris qui sert a préparer le tampon. C'est fait maison ?

Oui, notre tampon est fait maison, il faudra que l'on vérifie son pH.

Pour vous donner plus de détails, le tampon de charge que l'on n'utilise pas peut rester bleu longtemps alors que celui que l'on utilise (ouverture du falcon, trempage de cones de pipette dedans...) vire au jaune dans les semaines qui suivent...

[LXR]

C'est tout de même bizarre dans la mesure où votre Laemmli est tamponné. Reste à savoir quelle est la concentration en Tris utilisé, si c'est inférieur à une dizaine de mM, cela peut se comprendre (pouvoir tampon modéré).

D'autre part, les cônes que vous trempez dedans sont normalement secs et propres, donc aucune raison d'apporter des éléments faisant varier le pH. C'est assez intrigant.

[piwi]

Le tampon n'est pas au bon pH ou le processus d'extraction rend des protéines à un pH acide. Ça m'était arrivé quand j'en purifiais. Le bleu redevient bleu dans le gel parce que lui peut tamponner le faible volume de dépôt. Au pire vous ajoutez une goutte de tris 1M pH 9.5. Reste que si votre protocole n'est pas supposé faire cela, vous devriez contrôler vos solutions.

Cordialement,
piwi

[invitebef535e4]

Nous avons refait du nouveau bleu. A moins que celui-ci ne vire à nouveau au jaune, le mystère restera entier...

En tout cas merci pour vos réponses.