Immunocytolocalisation - Anticorps primaire 3-4h ?

[invite0e9887ab]

Bonjour à tous !


Je dois faire des immunolocalisations sur cultures cellulaires. Mon anticorps primaires fonctionnent vraiment très bien (anti-FLAG M2).

Pour une question de timing, j'aurais voulu faire ces immunos en un jour. L'avez-vous déjà fait ?
Je pensais tester une hybridation de l'Ac primaire durant 3-4h. Est-ce que cela vous inspire ou pensez-vous que c'est perdu d'avance ?


Sinon, la deuxième alternative est de les fixer est de faire mon immuno plus tard....


Merci d'avance pour votre aide !


Dizaal
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[Flyingbike]

Ca peut très bien se faire, mais il y a tellement de paramètres que la meilleure solution est de tester

[invite0e9887ab]

Ca peut très bien se faire, mais il y a tellement de paramètres que la meilleure solution est de tester

Ok merci ! En effet, il faut tester mais c'est toujours mieux de savoir que cela a déjà été fait

Merci pour ta réponse.

Je vais tenter cela... On verra bien ! J'ai réussi à trouver quelqu'un qui le fait sur tissu (min 1h d'incubation). Donc sur culture cellulaire cela devrait fonctionner.


Dizaal

[inviteba148c21]

Salut !

Pour avoir fait pas mal d'immuno-Histo et immuno-cytologie, je te conseillerai pour ma part de faire 1H d'anticorps primaire (LARGEMENT suffisant) et 1H de secondaire si besoin.
Tu peux laisser à température ambiante, ce qui facilite la réaction anticorps-antigène.
Pour ce qui est d'immuno-Hisologie, si tu dois en faire, effectivement 3H est le minimum pour l'anticorps primaire.

PS : j'ai toujours pour ma part fixer mes cellules, 15 minutes de fixation, 1H de marquage primaire, une heure de secondaire, en commencant le matin tu peux meme allez observer tes cellules l'apres midi !

BenJ

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteba148c21]

PS : Je pense que tu le sais déja, mais si ta protéine est intracellulaire, quoiqu'il arrive il faudra perméabiliser tes cellules. La PFA est très bien pour cela, fixateur et permeabilisateur en même temps.

Bon marquage !

[invite0e9887ab]

Hello !


Merci pour tous ces conseils.
Oui en effet, je savais pour la perméabilisation. En revanche, je ne savais pas que la PFA pouvait également servir de perméabilisateur.

Pour ma part, je fais 30 min de fixation et ensuite tous les lavages et incubations avec des tampons contenant du Triton.


En tout cas, je vous confirme bien que cela fonctionne ! Comme je n'avais pas encore lu les dernières réponses, j'ai fait 30 min de fixation, blocage au lait 10% pdt 1h, 3h d'anticorps primaire et 1h d'anticorps secondaire.

J'avais deux anticorps. Ils ont tous les deux super bien marqué ! Qu'elles sont beeeeellless mes cellules

Ça fonctionne de tonnerre ! J'en ai fini avec les immunos sur deux jours. Pouah.


La prochaine fois, je teste 2h.... puis 1h peut-être...



A++