probleme de signal southern

[invited039bd6b]

Bonjour tout le monde !

Je suis déséspérée ! Voila bien 6 mois que j'essaye d'améliorer le signal de ma sonde ADN marquée pour la révélation de mes southern blot !

J'utilise le kit de marque DIG Oligonucléotide 3'End Labeling de chez Roche, pour marquer une sonde ADN de 18 bases et le signal obtenu lors de mes manips est inutilisable. On voit bien qu'il ya de l'ADN mais ce n'est pas quantifiable.

J'ai essayé plusieurs choses, augmenter les concentrations, changer tout mes tampons, changer la sonde a marquer, changer le kit de marquage, utiliser une sonde purifiée par HPLC...

Et la je ne sais plus ...

Si vous pouviez m'aider
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[gorben]

tu es sure que ce n'est pas un probleme du southern? Genre ton ADN non/mal denature? ou ton ADN degrade?

As tu un controle positif qui marche? Une autre sonde a une position completement differente? Si tu as tout change et que tu fais tout correctement, c'est que le marquage n'est pas en cause. Le southern est quelque chose d'assez complexe a faire avec pas mal d'etapes. Il y a peut etre une etape qui est mauvaise

Bonne chance

[invited039bd6b]

tu es sure que ce n'est pas un probleme du southern? Genre ton ADN non/mal denature? ou ton ADN degrade?

As tu un controle positif qui marche? Une autre sonde a une position completement differente? Si tu as tout change et que tu fais tout correctement, c'est que le marquage n'est pas en cause. Le southern est quelque chose d'assez complexe a faire avec pas mal d'etapes. Il y a peut etre une etape qui est mauvaise

Bonne chance

J'ai pensais que le probleme ne venait pas du southern mais du marquage parce que mes marqueurs de poids moléculaires, qui sont eux marqués en Random primed donnent un superbe signal.
Idem pour l'ADN ou tout les échantillons réagissent de la meme facon..
c'est vraiment frustrant d'enchainer les manips sans avoir de résultats utilisables

[gorben]

Bizarre... Tu as essaye de mettre plus d'ADN?
Quand je faisais mes southern, je les faisais avec une sonde marquee sur toute la longueur (elle etait plus longue d'ailleurs) avec un kit de chez Amersham. Mais normalement la dig marche bien, c'est ce que j'utilisais pour les EMSA. Tu as fais une quantification de ton marquage de la sonde (dilution en serie de ta sonde et revelation pour voir ou se trouve ton meilleur signal)? Tu as essaye de faire synthetiser ta sonde directement avec la dig?
Bonne chance

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited039bd6b]

Bizarre... Tu as essaye de mettre plus d'ADN?
Quand je faisais mes southern, je les faisais avec une sonde marquee sur toute la longueur (elle etait plus longue d'ailleurs) avec un kit de chez Amersham. Mais normalement la dig marche bien, c'est ce que j'utilisais pour les EMSA. Tu as fais une quantification de ton marquage de la sonde (dilution en serie de ta sonde et revelation pour voir ou se trouve ton meilleur signal)? Tu as essaye de faire synthetiser ta sonde directement avec la dig?
Bonne chance

Oui j'ai essayé de varier les concentrations des ADN a utiliser et j'utilise également ma sonde à la concentration optimum.
par contre faire synthétiser ma sonde directement avec la dig est une bonne idée ! Si je peux j'essayerais

[gorben]

par contre faire synthétiser ma sonde directement avec la dig est une bonne idée ! Si je peux j'essayerais

Ca depends du signal que tu as. Si ton signal de la sonde est faible de base ca peut valoir le coup. Sinon c'est cher pour rien.