Southern blot

[invite481f0dd7]

Salut est ce que quelqu'un pourrait me dire a quoi servent les étapes de dénaturation , neutralisation et d' irradiation aux UV lors d'un Southern
merci
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[invitef1b4a1e8]

dénaturation: pour supprimer les structures secondaires et donc n'avoir des simples brins qui pourrnt s'hybrider avec la sonde.
pour le reste, je ne sais pas (qu'est-ce que tu entends par neutralisation?)

[invitec9f0f895]

L'irradiation aux UV permet de photoponter les molécules d'ADN a la membrane de nitrocellulose. Ceci permet d'eviter de perdre les fragments d'ADN lors des hybirdations.

YOyo

[invite9e6bc039]

La neutralisation sert à tamponner (après dénaturatio) étant donné que tu dois hybrider avec une sonde par la suite... Les UV servent à "ponter" l'ADN comme l'a dit YoYo, cependant cette étape est facultative, et certains sautent cette étapes... (pas moi en tout cas )

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite481f0dd7]

merci à tout le monde

[invite986e7815]

j'ai calcule ma Tm, je trouve 75C pour l'hybridation. Le protocol du labo parle de 65C. Je pense que 70C c bon n'es ce pas?

Es ce que le tampon de lavage ds des conditions de stringence doit etre augmente de 55C (sur le protocol du labo) a 65C. Sachant que pour l'instant je n'ai modifier que la force ionique du tampon de lavage est j'ai obtenu un coup un film blanc, un coup film noir.... Je me dis dc qu'il faut plus jouer avec la temperature...

Mon tampon d'hybridation a une concentration de 0,5M, c'est ce que conseille amersham...
Mon fragment a un tx de GC% de 32,3, et, ma sequence fait 897pdb.

HELP ME PLZ!

[invite986e7815]

j ai oublie de dire que ma Tm pour mon lavage est de 67C...