Réalisation d'un Southern Blot

[invitea74316c7]

Bonjour à tous!
Voila, j'ai réalisé pour la première fois il y a environ 1 mois un southern blot mais certaine choses sont encore un peu floue pour moi! Ainsi, pourquoi lors de la préhybridation et de l'hybridation utilise ton du SDS qui est un détergeant anionique?

Ensuite, auparavant nous avons utilisé des colonnes QiaQuick pour extraire de l'ADN d'une gel d'agarose, pour cela nous avons d'abord pris un tamp PE et ensuite un tampon EB pour élué, donc si je ne me trompe pas, le tampo PE doit être à pH neutre et le EB basique, est ce juste?

Je vous remerci d^'avance
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[invitea74316c7]

Encore une question: hors mis un northern blot et western, quelle autre technique pourrait être utilisée pour détecter une séquence génique dans de l'ADN?

[invite7ebb6db4]

Desolé pour tes autres questions, ou ma seul reponse qui cependant n'est vraiment pas sur est: SDS detergeant anionique car l'ADN est chargé negativement ( il y beaucoup de phosphate).
Mais il me semble que tu fais une erreur majeur en considerant le northern et le western sont des techniques pour depister se que tu appel sequence genique.
Northern: mise en evidence d'ARN.
Western: mise en evidence d'une proteine.

Sinon la PCR me parrait une bonne technique pour la mise en evidence d'une sequence sur l'adn (probleme, il faut connaitre la sequence; mais bon il faut aussi connaitre la sequence pour le southern).

[invitea74316c7]

Oui c'est vrai que j'ai trop généralisé en ce qui concernce le western et le northern! Sinon effectivement je n'avais pas pensé à la PCR, la méthode taqman pourrait être utilisée dans ce cas non?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0f4b54db]

Bonsoir,
Le SDS joue entre autres le role d'un "agent mouillant" qui va permettre aux differents constituants du tampon (de préhybridation, d'hybridation) d'atteindre la membrane. Dans un Southern blot l'hybridation entre la cible et la sonde n'est pas "libre" comme dans une solution car l'ADN cible est fixée à la membrane de nylon et il y a une interaction complexe à l'interface entre une membrane solide et un liquide.
Pour plus de précisions je passerai le relai (à des physiciens...)
Bonne futures hybridations !

[invitea74316c7]

Très bien merci pour ces indications mais quand tu dis que le sds permet d'atteindre la membrane, quels sont les constituants qui empechent d'atteindre la membrane?
Le SDS est utilisé lors de la phase de lavage à la fin de l'hybridation donc ton explication me semble bizarre dans ce cas la!

[gorben]

Salut,

Sans etre sur, (n'ayant jamais fait de southern) j'aurais tendance a penser que le SDS en tant que detergeant anionique permet de laver la membrane et de decrocher les interractions non specifique entre l'ADN (charge -) et la membrane de nylon (chargee +). Le SDS va prendre la place de l'ADN.

A+

[invitec9f0f895]

salut

en effet le SDS permet de laver la membrane avec une stringence plus importance afin de diminuer le bruit de fond.

Yoyo

[invite0f4b54db]

Re-bonsoir,
le SDS permet effectivement de laver avec une stringence plus importante (sans augmenter la température ou diminuer la force ionique).
Pour imager un peu, le SDS est un savon , et on lave mieux avec du savon que sans ! et comme le nylon chargé positivement des membranes n'est pas forcement très hydrophyle, il permet aussi de mieux réaliser l'interface entre ADN/Membrane et la solution.

à bientot