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[biologie moléculaire] Southern blot




  1. #1
    wishangel

    [biologie moléculaire] Southern blot

    Bonjour a tous,

    je viens chercher de l'aide auprès de personne utilisant la technique de Southern blot. Je vais essayer de faire court pour expliquer mon problème. En gros je n'arrive pas à avoir de signal pour mon adn génomique.

    J'ai commandé récemment une sonde marqué à la biotine. J'ai d'abord essayé plusieurs conditions mais ca ne donnai rien. Pour essayer de savoir d'ou viens le pb j'ai transféré mes produits de digestion de genomique et des produits de PCR. En parralele j'ai "doté" directement les produit de PCR sur la membrane. Au final j'ai un signal pour tout sauf mes produits de digestion.
    J'ai alors pensé à un problème de sensibilité. J'ai alors transféré des concentrations croissante en produits de digestion et toujours rien. Au labo il n'y a que moi qui utilise cette technique du coup je me retrouve perdu!!! Alors si vous avez des idées pour m'aider elles sont le bienvenue.
    Merci d'avance

    -----


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  3. #2
    haile

    Re : Southern blot

    je n'ai pas très bien compris... tu peux expliquer ce que tu entends par "mes produits de digestion de genomique"

  4. #3
    wishangel

    Re : Southern blot

    pardon je fait des essai sur des bacteries. Donc je digere l'adn génomique avec une enzyme de restriction. Je fait migrer sur agarose et je transfert


  5. #4
    haile

    Re : Southern blot

    tes produits de pcr contiennent la séquence reconnue par la sonde, si j'ai bien compris, dis moi si je me trompe... donc tu as doté directement pour voir si le problème vient du transfert, étant donnés les résultats, il semblerait que non... tu dis également que ce n'est pas un problème de sensibilité.

    le problème ne pourrait-il pas venir:
    -de ta sonde (sauf si le produit de PCR est exactement le même que celui que tu devrais obtenir après digestion)
    -de tes enzymes?

    mais franchement, si tu ne disais pas que tu as essayé de grosses concentrations, je penserais tout de suite à un problème de sensibilité.
    le meilleur conseil que je puisse te donner, c'est de revoir à chaque étape s'il y a des points critiques, et faire le nécessaire pour vérifier si toutes les conditions ont été remplis...

    je ne suis pas chez moi actuellement, mais si tu veux, dès ce soir, je peux me replonger dans mes cours de génomique et essayer de voir d'où vient le problème, si personne n'a trouvé la solution d'ici là

  6. #5
    mantOs

    Re : Southern blot

    Avant de transferer as tu essayé de révéler au BET ton gel voir si tu as bien ton ADN digéré?
    Desole pour l'absence d'accentuation, je suis sur clavier QWERTY.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    wishangel

    Re : Southern blot

    L'ADN que j'utilise pour la PCR et celui que je digere provient de la meme extraction. Donc mon produit de PCR est un fragment de mon génomique.
    Sinon j'ai bien pensé a un pb de digestion mais effectivement je colore au BET pour verifier et a priori la digestion semble correct.Je recolore mm mon gel apres transfert. Mais comme je l'ai dit j'ai pas vraiment de repère. Ce que je peut faire c'est mettre en piece jointe les résultat des différentes étapes si ca peut vous aider a m'aider!!!!

  9. #7
    haile

    Re : Southern blot

    non mais vraiment, à partir de tout de que tu as fait, je ne vois vraiment rien à part la sensibilité, mais si tu as fait les tests nécessaire comme tu le dis, pour ma part, je ne peux plus tellement t'aider, désolé.

    essaie toujours de donner en pièce jointe tes résultats, ça pourrait servir

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  11. #8
    jmbowie

    Re : Southern blot

    Est-il possible d'imaginer que ton produit de PCR (ta sonde) se trouve en fait à cheval sur un site de restriction? Ainsi, ta sonde ne peut reconnaitre son site car il a été digéré et, dans les conditions que tu utilises (l'éventail de conditions), ne peut se fixer ni sur l'un ni sur l'autre.

    Exemple: Sonde= CATGGACggatccACACA (site BamHI en minuscule)

    En gros, est-ce que ta sonde contient un des sites avec laquelle tu digères l'ADN génomique?

  12. #9
    wishangel

    Re : Southern blot

    Etant donné que j'essayé de trouver les conditions optimal de ma sonde je travail sur un adn connu. J'ai donc choisi mon enzyme de restriction de facon a ce qu'elle ne coupe pas mon gene. En plus j'ai 3 copie du genes qui sont legerement differente!!!! Vous comprenez pourquoi je suis autant desespéré!!! Pour etre sur je pourrai tester plusieurs enzyme. Ce que je n'ai pas encore fait!!

  13. #10
    jmbowie

    Re : Southern blot

    tu devrais nous filer ton protocole, qu'on te dise ce qu'il peut éventuellement clocher :/

  14. #11
    Yoyo

    Re : Southern blot

    salut

    c'est probablement un probleme de sensibilité vu que tu arrives a hybrider sur tes PCR. Ou alors ton genomique est "sale" tu fait un phenol/chloroforme avant de le faire migrer?

    Sinon tu pourrais essayer de marquer ta sonde au P32 si tu as le droit de manipuler la radioactivité c'est beaucoup beaucoup plus sensible.

    Yoyo

  15. #12
    wishangel

    Re : Southern blot

    Merci pour votre aide en tout cas.
    Pour le protocole je vous le met qd j'ai un moment.
    Sinon pour recup mon génomique je fait une extraction classique Phenol, phenol/chlo/a.iso, chlo/a.iso.
    Pour cette échantillon je n'était qu'a 250ng/µL mais j'ai concentré mon adn par précipitation EtOH/Na Ac. J'ai concentré 2x, 3x, 4x, 5x et 6x et j'ai utilisé 25µL pour ma digestion...Donc au final j'ai une gamme qui va d'environ 5 à
    30µg d'ADN. Je scan mon gel apres migration des produit digéré des que j'ai un moment.
    Sinon malheureusement notre salle de radioactivité vient d'être supprimé et la décontamination est déja en cours. Je peut toujours essayer de voir si y a une labo à coté qui m'acceuillerai le temps d'une manip...

  16. #13
    wishangel

    Re : Southern blot

    Up du sujet car c'est assez important!!!

  17. #14
    haile

    Re : Southern blot

    tu n'as vraiment personne dans le labo qui s'y connait sur le sujet?

    c'est un labo de recherche?

  18. #15
    gorben

    Re : Southern blot

    Salut,

    Tu n'hybrides rien du tout, ou tu as tes puits "sales".

    J'ai deja eu un probleme similaire au tiens. En fait mon ADN etait mal digere, du coup il ne rentrait pas ou tres peu dans le gel, et la quantitee visible aux UV etait trop faible pour etre detectable.
    Tu peux essayer de spoter ton ADN genomique, pour voir si tu obtiens quelaue chose.

    A+

  19. #16
    karla

    Re : Southern blot

    salut wishangel !

    tu as dit en avril que pour ton southern blot tu avais mis directement l'ADN sur ta membrane et que ca avait marche.
    moi c'est ce que j'essaie de faire mais rien: pas de signal.
    est ce que tu utilises une nylon membrane? combien de temps tu attends apres avoir directement pose ton dna sur la membrane? comment tu le denatures (NaOH?), fixe (UV light?)? et est ce que tu utilises une solution "church" pour prehybrider? est ce que tu penses que c'est possible de m'envoyer ton protocole qui a marche?

    Je te remercie d'avance pour tes reponses!

    Karla.

  20. #17
    karla

    Re : Southern blot

    merci beaucoup Ange! je vais chercher le Dig easy Roche .

    Mais tu crois que cela change quelque chose si je transfert d'abords l'ADN sur la membrane et apres je trempe la membrane dans 0.5M NaOH/1.5 NaCl?

    Je veux faire ca car apres je veux refaire la manip en deposant non pas de l'ADN sur la membrane mais une colonie de E.coli. Et le lavage par NaOH me servira non seulement a denaturer l'ADN mais aussi a casser la cellule (car je dois en fait faire un southern sur une library entiere de cellules..)

  21. #18
    wishangel

    Re : Southern blot

    Pour le traitement NaOH sur la membrane directement je peut pas te dire car j'ai jamais fait. Faudrai verifier que ca n'abime pas ta membrane. Sinon pour tes test sur coli pourquoi ne pas faire une extraction avant?

  22. #19
    karla

    Re : [biologie moléculaire] Southern blot

    parce que je veux faire ca sur toute une bibliotheque de E.coli...je vais transferer tous mes clones sur une meme membrane et faire le southern dessus...

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