Apoptose et le gène Bax

[invite90852247]

Bonjour.

J'ai à étudier l'effet pro-apoptotique de la toxine émétique (=céréulide) de Bacillus cereus sur des cellules 3T3 en culture.
Après culture des cellules, de la bactérie et extraction de la toxine, la toxine sera mise en contact avec les 3T3.
Pour détecter ensuite l'apoptose, je pense extraire les ARN totaux de mes cellules (phénol-chloroforme-alcool isoamylique), puis faire une RT-PCR grâce à des amorces spécifiques du gène Bax.
Certaines publications disent que Bax s'exprime toujours lors de l'apoptose, mais d'autres, moins détaillés peut-être, ne le précisent pas.

Voilà maintenant mon problème : la protéine Bax, une fois exprimée, se dimérise et forme des pores dans la membrane mitochondriale, aboutissant à la libération de cytochrome c, AIF etc etc et déclenchement de la voie intinsèque de l'apoptose.
La toxine forme également des pores dans la membrane mitochondriale, et aboutit au même résultat.

En choisissant de détecter l'expression de Bax, n'est-ce pas trop en amont dans le phénomène?
En gros Bax et céréulide ont le même effet au même niveau, donc je me demande si Bax sera tout de même exprimé en induisant l'apoptose avec la toxine...


Sachant que pour des raisons de budget et de temps, je ne peux absolument pas modifier mon protocole.

Merci d'avance aux connaisseurs!
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[invite853321bf]

Mais là tu étudies la transcription de bax, es tu sur que ce soit la même chose que l'expression de la protéine ?

[invite90852247]

Oui mais les deux sont liés, si on trouve l'ARNm de Bax, par déduction le gène est exprimé, etla protéine est synthétisée ensuite...
Mais notre détection se situe au niveau de l'ARNm.

[invite853321bf]

Ce n'est pas forcément parce que l'ARNm est transcrit qu'il est traduit, il existe des mécanismes de régulation à ce niveau aussi, suivant la nécessité du mécanisme.
Attention, je ne dis pas que c'est le cas pour bax, je n'en sais rien, mais à ta place je trouverais un papier prouvant cela, car sinon ce sera tes examinateurs qui te piégeront.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite71f23525]

Pour définir s'il y a apoptose ou pas, regarder l'expression de Bax est déjà trop spécifique. En plus, on regarde très rarement son expression au niveau de l'ARNm mais au niveau protéique.

Le top pour commencer à définir s'il y a apoptose ou pas c'est un marquage Annexin V/ PI des cellules et analyse en cytométrie de flux. Je ne connais pas les moyens dont disposes ton labo ni si cela fait partie d'un projet de recherche mais je commencerais par là (enfin pas vraiment, il faudrait déjà commencer par regarder la mort cellulaire globale en bleu trypan et/ou marquage PI en cycle cellulaire). Ce que tu peux faire qui est peu coûteux mais d'une efficacité toute relative, c'est un marquage de l'ADN de tes cellules au DAPI et visualiser au microscope à fluorescence la présence de noyaux condensés/fragmentés. Beaucoup d'autres moyens sont possibles mais pour rester assez général, c'est ce que je vois en premier.

[invite90852247]

Merci pour vos réponses.

Effectivement nous n'avons pas pensé à la régulation ARNm/protéine, je n'avais pas compris ta réflexion kamor!

C'est un sujet de projet tutoré d'IUT Génie Biologique option Analyses Biologiques et Biochimiques, avec un budget de 200euros.

D'emblée nous avions pensé à la cytomètrie en flux avec marquage annexine V, car l'IUT possède un cytomètre (un peu âgé mais fonctionnel), mais le coût restait trop élevé...
Et pour le DAPI, pas de microscope à fluorescence

Nous avons des solutions de secours au cas où la RT-PCR ne fonctionnerait pas, avec le MTT, le bleu trypan, associé à une étude de cytotoxicité. Mais ça montre toutes les cellules mortes, pas uniquement les cellules apoptotiques...

Tant pis, nous allons essayer, et comme disent nos profs : "Obligation d'action, mais pas de résultats! Sachez seulement expliquer pourquoi ça n'a pas fonctionné."

[Flyingbike]

entièrement d'accord avec LXR, si on pouvait mesurer l'apoptose par pcrq ca serait plus simple. Le tunel est trop cher aussi ?

Tu parles d'autres méthodes (MTT, bleu trypan, etc.). Ce n'est pas le plus adapté mais c'est techniquement plus recevable que l'expression de Bax je pense.

[invite853321bf]

Maintenant tu peux tout à fait regarder l'effet de la toxine sur la transcription de bax. Par contre, tu ne pourras pas dire beaucoup plus de chose sur sa traduction. En même temps, c'est bien, ça te fait déjà quelque chose à placer dans la partie perspective