Détection au cytométre de Flux

[invitecd912a4d]

Bonjour,

je suis actuellement en stage de M1 qui m'a conduit à effectuer un marquage FACS pour détecter la présence d'un CMH de classe I produit à partir d'un transgène (transfection par lipofectamine)

Mon problème se situe au niveau des résultats obtenus. J'utilise un anticorps couplé à du PE et les cellules sont perméabilisée à la saponine car le CMH de classe I que je souhaite détécté à été rendu soluble. Je commence donc par passer mon témoin négatif (cellules perméabilisées non transfectées + Ac-PE), j'obtiens un pic normal. Et quand je passe mes cellules transfectées, j'obtiens un pic positif et un négatif, cependant, ce dernier s'est légèrement décalé sur la droite comparé au témoin négatif, une sorte de shift. Impossible de comprendre pourquoi.

Je précise que rien n'a été changé entre les deux essais, ni les paramètres, ni le gate, rien. Si une âme charitable pouvait m'apporter ses lumières, ce serait génial
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[invitea9b6b5a8]

As tu essayé d'utilisé comme témoins négatif des cellules transfectées perméabilisées?
Normalement tu dois utiliser comme témoin négatif les mêmes cellules mais sans l'anticorps.
Il arrive aussi que l'exces d'anticorps (notamment en l'absence de lavage) entraîne un shift de la négative.

[invitecd912a4d]

Merci de m'avoir répondu.

J'ai 4 échantillons en réalité :
- Cellules non transfectées perméabilisée
- Cellules non transfectées perméabilisée + anticorps
- Cellules transfectée perméabilisée
- Cellules transfectées perméabilisée + anticorps.

Et seul le 4ème (le seul positif) me donne ce shift. J'ai également réalisé une autre manip semblable mais sans perméabilisation, en essayant de détecter mon CMH rendu soluble, et le CMH membranaire natif (tous 2 issus de transgènes). Et c'est le même problème, dès qu'il y a un pic positif, le témoin fait un shift à droite.

Enfin, les cellules ont été lavées après incubation avec l'anticorps, 3 lavages successifs au PBS BSA + centrifugation à chaque fois.

[inviteae6c05c4]

Bonjour,

J'ai du mal à saisir votre problème. Ce qui vous ennuie c'est que votre histogramme du témoin négatif transfecté n'est pas identique au témoin négatif non transfecté ? Si c'est cela, ce n'est pas réellement un problème, probablement que votre transfection a modifié quelque peu le phénotype des cellules.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitecd912a4d]

Le décalage des témoins me paraissait trop important pour être seulement du à la transfection. D'après ce qu'on a pu me dire, ce décalage serait en fait du aux anticorps qui se fixent de manière non spécifique à des récepteurs Fc. Ce qui induirait une fluorescence supplémentaire. Additionné à la transfection, le décalage augmente.

On m'a donc conseillé de faire un témoin avec un anticorps isotypique PE de façon à prendre cette fluorescence non spécifique en compte.

C'est vrai que mon problème n'en est pas réellement un, mais j'avais peur de tomber sur cette question lors de ma soutenance sans pouvoir y répondre. Je recommence la manip cette semaine avec ce nouveau contrôle, ce qui devrait régler le problème.

Merci en tout cas de votre aide.

[invitea9b6b5a8]

Le décalage des témoins me paraissait trop important pour être seulement du à la transfection. D'après ce qu'on a pu me dire, ce décalage serait en fait du aux anticorps qui se fixent de manière non spécifique à des récepteurs Fc. Ce qui induirait une fluorescence supplémentaire. Additionné à la transfection, le décalage augmente.

On m'a donc conseillé de faire un témoin avec un anticorps isotypique PE de façon à prendre cette fluorescence non spécifique en compte.

C'est vrai que mon problème n'en est pas réellement un, mais j'avais peur de tomber sur cette question lors de ma soutenance sans pouvoir y répondre. Je recommence la manip cette semaine avec ce nouveau contrôle, ce qui devrait régler le problème.

Merci en tout cas de votre aide.

Tu peux aussi utiliser du Fc blocker pour limiter ce marquage non spécifique.

[inviteae6c05c4]

On m'a donc conseillé de faire un témoin avec un anticorps isotypique PE de façon à prendre cette fluorescence non spécifique en compte.

Mais euh, jusqu'à maintenant, comment avez vous avez établit vos paramètres pour le témoin négatif sans contrôles isotypiques ?