Bonjour,
Je réalise un clonage hétérologue d'une protéine (VapA).Le gène codant ma protéine d'intéret est exprimé (étude ARN ok) mais le problème est qu'elle est indedectable que ce soit au sein de la bactérie (Mycobacterium marinum) ou du surnageant en Western blot... Auriez vous quelques idées sur pourquoi elle n'est pas détectable?
Merci à tous
Le fait que l'ARNm soit présent n'indique pas grand chose, sauf qu'effectivement ton promoteur fonctionne correctement. Il se peut que ta séquence soit mutée conduisant a un mauvais repliement et à l'élimination de la protéine avant même sa mise en fonction! As tu séquencé ta séquence d'adn?
comment la détectez-vous ? western ? avez vous un contrôle positif ? (problème d'anticorps, etc)
sinon, avoir un messager de donne pas toujours de protéine. Il faut des régions régulatrices et pas uniquement la séquence codante.
La séquence est correcte puisqu'elle a été séquencé et est à 100% identique à l'originale. La protéine vient de Rhodococcus equi et a été cloné dans M. marinum. Ses deux organismes appartiennent au groupe des Nocardia et ont un GC% plus ou moins semblable (65% environ)
La protéine est détectée par Western blot et le contrôle positif est correcte. A quel niveau sont sensé agir les régions régulatrices? Lors de la traduction? N'est ce pas un peu tard une fois que les ARNs sont synthétisés?
Ce que je veux dire, c'est qu'un ARN qui ne contient que la région codante de ta protéine ne donnera pas de protéine. Il faut un site de fixation du ribosome, des éléments de régulation, etc. La régulation a lieu au moment de la transcription, de la stabilité du messager mais aussi lors de la traduction. Plusieurs éléments entrent en jeu dans cette régulation.
et lorsque tu dis que la séquence est OK, on parle des messagers ? parce que peut être que le messager detecté n'est pas correct.
Non la séquence du messager n'a pas été testé. En revanche l'ARN a été retrotranscrit et l'ADNc a bien été amplifié par les primers. La taille du fragment correspondant il peut toujours y avoir eu des mutations mais sur tout les ARNs ca me semble impossible
Le clonage a été effectué dans quel vecteur?
Il faut absolument séquencer la construction que tu veux introduire dans ta bactérie, sinon tu ne peux pas être sur que la construction est OK.
Le clonage a été effectué dans un plasmide intégratif pMV361 et le gène cloné est sous la dépendance du promoteur hsp60
Je partage l'avis de sr. Il faudrait que tu séquences la construction. Tu n'es pas obligé de séquencer l'intégralité, tu peux juste choisir des primers de part et d'autre de ton insert, s'hybridant sur le vecteur, pour avoir la séquence des jonctions (c'est la zone la plus critique lors d'un clonage). Tu pourras ainsi voir si l'insertion s'est bien faite en respectant le cadre de lecture si c'est une protéine de fusion, ou si les extrémités de ton insert son bien celles attendues.
Commence par vérifier si il n'y a pas un problème évident : clonage raté (vérifie la séquence), anticorps de mauvaise qualité, antibiotique oublié, etc...
Ensuite, vérifie si ta protéine est adaptée à l'expression hétérologue en bactérie. Si ta protéine entre dans au moins une des catégories suivantes, ça peut etre compliqué :
- Si la protéine est membranaire et/ou fait plus de 100 kDa par monomère, c'est quasiment sans espoir en bactérie, change de système (baculo par exemple)
-Dans les cas restants, ça s'annonce compliqué si la protéine est multidomaines
- Reste le dernier cas problématique dans lequel tu te trouves très probablement étant donné que le taux de GC est très élevé : la protéine est intrinsèquement peu/pas repliée et elle finit en corps d'inclusion ou elle est dégradée par les protéases bactériennes.
Dans les deux derniers cas, la situation peut etre rattrapable en bactérie. Si ce qui t'intéresse, c'est de produire la protéine pour l'utiliser ensuite dans diverses manipes, passe en E. Coli et privilégie la souche "Rosetta" qui est particulièrement adaptée à ce genre de cas. Ensuite, abaisse la température d'expression : fais pousser tes bactéries à 37° puis abaisse la température à 18° quand la DO ateind 0.3. Laisse ensuite incuber ON avant de lyser les bactéries.
Que tu puisses passer en E. Coli ou non, il faut soigner particulièrement l'étape de lyse des bactéries, c'est une étape cruciale. Travaille dans la glace exclusivement. Utilise des inhibiteurs de protéases (par exemple, les tablettes d'anti-protéases de Roche sont pas mal). Si ta protéine ne contient pas de magnésium, rajoute 5 mM d'EDTA au tampon de lyse, ça détruira une bonne partie des protéases.
Dernière possibilité, si ta protéine est produite à un taux extrêmement faible, il existe des méthodes pour enrichir la concentration des protéines faiblement exprimées dans des échantillons protéïques totaux. Cela permet d'augmenter le signal de ta protéine et de la détecter par Western
Une question importante qui n'a pas été posée : l'ARNm est-il fortement exprimé ou peu? Je ne sais pas si tu as quantifié sa présence en faisant une qPCR mais selon le nombre de cycles où sort ton gène, on pourras te dire si tu peux t'attendre à détecter une protéine ou pas.
(Je ne sais pas chez les procaryotes, mais du moins chez les eucaryotes, un gène qui sort au-delà de 30 cycles est souvent difficile à détecter en protéine. On voit donc son expression ARNm mais elle est trop faible pour produire suffisamment de protéine pour être détecté en western).
Avant tout merci à vous tous pour toutes vos réponses qui sont très intéressantes et ouvrent de nouvelles perspectives.
L'ARN semble suffisamment exprimé puisqu'il est détecté assez clairement avec 30 cycles d'amplification. Sur WB j'obtiens deux bandes de tailles différentes pour mon contrôle positif mais seulement une bande très très haute dans le gel (très grosse protéine) comparé aux autres dans le reste de mes conditions. Le problème est que la bande est également mis en évidence chez les témoins négatifs (souche ayant intégré le vecteur sans l'insert). Ceci m'amène à une question: est-il possible que le système bactérien ai détruit ma protéine car elle a été reconnu comme différente par rapport à celle mis en évidence sur le WB?
La séquence cloné a été séquencé et est correcte en revanche ce que je n'ai aps séquencé c'est le cDNA issu de l'extraction ARN mais je doute qu'il y ai un problème dans la séquence.
Svenn :Je serais surpris qu'il y ai un problème de GC% étant donné que le gène inséré est issu d'une bactérie possédant environ le mm GC très élevé (environ 65%) et qu'il appartiennent au même genus. Mais je trouve cette hypothèse très plausible. La manip d'inhiber les protéases me semble interessante je vais sérieusement y réfléchir.
Encore merci pour toutes vos réponses et si vous avez d'autres idées elles sont le bienvenu. J'espère avoir été assez clair dans mes réponses.
Bon week end et vive la recherche!!!
Il faut inhiber les protéases dans un systeme bactérien.
