la transcription in vitro

[invitecdc852f9]

Bonjour à tous

Je ne sais pas pourquoi j'obtiens une fable quantité d'ARN quand je le purifier, malgré que mon matériel est Rnase free. Voici le Protocol que j'utilise
La transcription invitro:
ADN linéaire 1ug, ATP CTP GTP (10mM) 1.1ul, Rnase inhibitor (28UI) 1.5ul, DTT (10mM) 2.2ul, Tampon T7 10x 2.2ul, UTP*P32(800ci/mmol) 5ul, T7 enzyme (15UI/ul) 2ul.
La réaction a été incubée à 37C ensuite j'ai ajouté 1ul DNase (2UI/ul) et je l’ai incubé à 37C pendant 20min.
J'ai purifié ARN par le Rneasy mini Kit (qiagen) .
merci
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[Flyingbike]

Bonjour

Quel est ton template de départ ?

Ce n'est pas une réaction qui doit te produire des tonnes de matériel. Je ne suis pas sur que la purification utilisée soit la meilleure. Tes réactifs sont ils récents (DTT surtout) ?

[invitec9f0f895]

salut

rajoute de l'UTP non radioactif, tu n'as pas assez d'UTP dans ta reaction pour que ca marche bien.
Il suffit de purifier ton ARN sur une petite colone sephadex G25, pas besoin d'autre chose.

Yoyo

[invitecdc852f9]

merci de me repondre
j'utilise ADN plasmidique et pour DTT est neuf

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitecdc852f9]

Bonjour
j'ai déjà essayé d'ajouter UTP non radioactif mais malheureusement j’ai eu même résultat (pas amélioration).
et pour petites colone sephadex G25, est ce que si possible de m'envoyer le numéros de catalogue ainsi que le nom de la compagnie pour que j'achèterai les mêmes colonnes pour purifier mon ARN car j'ai testé deux kit de purification de deux compagnies, les résultats sont mêmes , j'aimerai bien de tester le même kit que vous utilisez actuellement et je comparerai les résultats.

[invitec9f0f895]

Salut

Es tu sure que la DNAse est RNAse free?, as tu vérifiée ta transcription AVANT purification? quelle taille fait ton ARN final? mes transcriptions durent en moyenne au moins 2H, pour des ARN de 300 à 500nt.

pour les colones: http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM10070
YOyo

[invitecdc852f9]

salut
le Dnase est Rnase free, car il est neuf ainsi que j'ai migrai ARN sur gel et je voix ma bande qui est de taille 300nt. Ma transcription in vitro dure 2h