Clonage par PCR taille des amorces

[invitee6ff25aa]

Bonjour à tous,

Une question simple: j'aimerais cloner un gène dans un vecteur pENTR. J'ai la séquence codante de ce gène dans un autre plasmide, je compte donc l'amplifier par PCR en rajoutant des sites de restrictions en 5' et 3' qui me permettront ensuite de le mettre facilement dans mon pENTR d'intérêt.
Je me demandais donc la taille que devait faire mes amorces de PCR, et si je dois prévoir quelques bases entre le début (et la fin) de ma séquence codante et mon site de restriction. Car je me demandais si en juxtaposant les 2 sans rien ajouter entre, est ce que la coupure/ligation ne va pas endommager ma séquence codante??

Merci beaucoup pour vos réponses.
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[invitee863e61a]

Bonjour à tous,

Une question simple: j'aimerais cloner un gène dans un vecteur pENTR. J'ai la séquence codante de ce gène dans un autre plasmide, je compte donc l'amplifier par PCR en rajoutant des sites de restrictions en 5' et 3' qui me permettront ensuite de le mettre facilement dans mon pENTR d'intérêt.
Je me demandais donc la taille que devait faire mes amorces de PCR, et si je dois prévoir quelques bases entre le début (et la fin) de ma séquence codante et mon site de restriction. Car je me demandais si en juxtaposant les 2 sans rien ajouter entre, est ce que la coupure/ligation ne va pas endommager ma séquence codante??

Merci beaucoup pour vos réponses.

En général les oligos font 20-30pb et on essaye d'avoir un ratio équilibré entre les G+C et les A+T (dans ces conditions, une PCR aux température d'hybdridation classiques 51-58°C doit fonctionner). La restriction coupe ton ADN proprement , pas besoin d'ajouter des bases pour "protéger" ta séquence codante. En revanche on conseille de rajouter quelques bases entre le le site et l’extrémité 5' de façon à internaliser le site car les enzymes de restrictions sont des ENDOnucléases, il faut que leur cible soit au milieu

[invite28f6e6c6]

Ce que je fait en général, c'est de cloner la séquence amplifié avec la présence des sites de restriction dans un vecteur de clonage pour fragment PCR. Ceci permet d'avoir des morceau d'ADN de part et d'autre des sites de restriction. Je clone ensuite le fragment dans mon vecteur d'expression.

[invitee6ff25aa]

Super merci beaucoup pour vos réponses!

[A voir en vidéo sur Futura]