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Question théorique sur clonage TOPO



  1. #1
    abuelita9110

    Question théorique sur clonage TOPO

    Bonjour à vous, j'espère que vous pourrez m'aider je passe un oral cet après midi (16h) et je ne comprend plus un paragraphe que j'ai écris dans mon rapport de stage :

    Le plasmide pCR4 Blunt-TOPO vector (Figure11) nous est fourni sous forme linéaire, il possède en 3’ une topoisomérase I du virus Vaccinia. Cette topoisomérase a la capacité de se fixer à des sites spécifiques de l’ADN et de cliver celui-ci au niveau des liaisons phosphodiesters, après le motif 5’-CCCTT. L’énergie libérée lors de cette réaction permet la formation d’une liaison covalente entre l’extrémité 3’ du brin coupé et le résidu tyrosyl-274 de l’enzyme. Cette liaison est ensuite attaquée par l’extrémité 5’ hydroxyl du brin d’ADN à insérer dans le vecteur, ce qui a pour résultats de libérer la topoisomérase I et de lier l’insert au vecteur (Figure12). Pour insérer les produits PCR dans le plasmide pCR4, on réalise donc une ligation qui se fait en 5 minutes.

    Je ne comprends pas comment on peut avoir une extrémité 5'hydroxyl ? j'ai lu sur internet que le produit PCR ne possédait pas d'extrémité 5'phosphate, est-ce pour cela ? Et si c'est le cas comment cela est-il arrivé ? je suis sûre qu'il s'agit d'une extrémité 5'hydroxyl car cela est écrit dans le manuel d'utilisation du plasmide (PCR4 blunt topo vector)

    De plus quelle liaison covalente se forme-t-il ? je veux dire entre quels atomes ?

    MERCI BEAUCOUP si vous pouvez m'aider je suis totalement en panique !!!!!!!

    -----

    Dernière modification par LXR ; 26/05/2011 à 15h44. Motif: Titre explicite

  2. #2
    LXR

    Re : Urgent question pour oral

    Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

    Un titre explicite est exigé par la Charte. La prochaine fois, ce sera une fermeture de la discussion en attendant que tu proposes toi-même un titre explicite par message privé.

    LXR pour la modération

  3. #3
    LXR

    Re : Question théorique sur clonage TOPO

    En faisant agir une phosphatase sur un produit de PCR, on obtient des extrémités 5'-hydroxyl puisque la phosphatase enlève le phosphate par hydrolyse.

    Quelle liaison covalente se forme entre quoi et quoi?

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