dot plot et overlay

[invite16a65033]

Je suis sarah, en 1 ère année de thèse en biologie.

Dans le but d'étudier les interactions entre 2 protéines, je voudrais faire un dot plot pour immobiliser ma première protéine sur la membrane de nitrocellulose, par la suite je voudrais faire un overlay ou j'incube ma membrane de nitrocellulose dans la solution de la deuxième protéine et je révèle les interactions par l'anticorps de la deuxième protéine.
J’ai cherché un protocole pour faire cette technique cependant je n'ai pas trouvé un protocole complet qui comporte le dot plot et l'overlay surtout que ceux qui font l'overlay commence par faire un western blot alors que moi j'évite de le faire pour ne pas dénaturer mes protéines.

Pourriez vous m'aider à retrouver un protocole complet sur l'overlay et la concentration de protéines que je dois déposer.
J’ai vraiment besoin de l'aide.
Je vous remercie
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[Flyingbike]

Ce n'est pas une technique très courante a ma connaissance, et à mon avis la façon de procéder dépend énormément de la nature des deux protéines dont on veut étudier l'interaction.
Il y a d'autres façons plus documentées de faire ce genre d'études. (IP par exemple)
Si tu es riche en matériel, tu peux commencer par faire des tests par toi même, par exemple en faisant une gamme de quantité a déposer, puis une gamme de concentration de ta solution de protéine, sans oublier les contrôles adéquats.
Pour ce qui est de l'overlay, a mon avis ça doit fortement ressembler a un WB (avec un blocage, lavages, etc)

[invite16a65033]

Merci beaucoup pour votre réponse.
En faite, comme j'en ai que peu des deux protéines je suis obligée de commencer par le dot plot et l'overlay pour voir les interactions possibles et par la suite je passerai a l'IP. J'ignore la quantité exacte de protéines que je dois déposer.
pour l'overlay, l'étape de la révélation est la même que celle du western blot.
je compte faire une gamme de concentration des deux protéines mais avant tout je dois trouver LE COMMENT de la technique.
n'hésitez pas a m'envoyer vos suggestions, ça me permettra d'avancer et ça va énormément m'aider.
Merci bien