PCR de clones

[inviteffbc6fc3]

Bonjour, comme la majorité des gens qui posent une question sur ce forum: je suis dans une impasse et j'ai besoin d'aide. Alors il y a encore quelques semaines, je pouvais amplifier par PCR classique l'ADN de lignées cellulaires avec mes contrôles (clones) et du jour au lendemain mes contrôles ne sortent plus. Ou du moins une fois sur 2, avec un signal qui diminue de plus en plus. C'est le bazar!!! J'arrive à amplifier l'ADN de mes lignées (dans une même PCR, avec un même mix) mais pas mes clones. Je ne comprends pas! Est-ce que quelqu'un aurait une piste svp?
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[TanguyE]

Bonjour,

Congèles-tu tes ADN contrôles? Parce que les cycles de congélation, décongélations ne sont pas ce qu'il y a de mieux pour l'ADN.

[inviteffbc6fc3]

Oui c'est vrai. J'y ai bien pensé mais les ADN des lignées subissent exactement les mêmes traitements que mes clones, autant de cycle de congélation décongélation. De plus j'effectue une dilution de mes clones. Ma solution mère ne subit que de très rare congél décongel. Alors, en partant de la même hypothèse que toi, j'ai refais une dilution: mais non même résultat. J'ai donc remis en culture mes glycérol stock: même résultat. En effet la dernière étape c'est refaire le clonage dès le début. C'est le programme de cette semaine. Mais toutes idées est bonne à prendre.
Merci pour ta réponse.

[invitee863e61a]

Oui c'est vrai. J'y ai bien pensé mais les ADN des lignées subissent exactement les mêmes traitements que mes clones, autant de cycle de congélation décongélation. De plus j'effectue une dilution de mes clones. Ma solution mère ne subit que de très rare congél décongel. Alors, en partant de la même hypothèse que toi, j'ai refais une dilution: mais non même résultat. J'ai donc remis en culture mes glycérol stock: même résultat. En effet la dernière étape c'est refaire le clonage dès le début. C'est le programme de cette semaine. Mais toutes idées est bonne à prendre.
Merci pour ta réponse.

Tes conditions de PCR sont peut-être limites et ne permettent pas une amplification 100% mais dépendent d'autres variables inter-manips. Tu es sûr de chacun de tes réactifs ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteffbc6fc3]

Bonjour jmbowie,
oui je suis sûr de mes réactifs car durant mes PCR il n'y a que mes clones qui ne s'amplifient pas, les lignées c'est bon. Si mes réactifs étaient "défectueux" je n'arriverais pas à amplifier l'ADN de mes lignées. Mais avant de poster un mot sur le forum, j'avoue que j'avais quand même pensé à ça. J'ai fais des tests et ... surprise: même résultats!
Là je vais tenter, en plus de mon clonage, une gamme de dilution sur mes clones. On va voir. Je n'y crois pas trop mais au point où j'en suis ça ne coûte pas grand chose d'essayer.
Merci quand même de t'être penché sur mon problème.
Avis aux autres Dr House de la bio mol!

[invitec9f0f895]

salut

J'ai du mal à être certain d'avoir bien compris. Tu parles de lignée de clones de clonage... pourrais tu préciser ta manip ? les PCR tu les faits sur ds clones de coli? (ou de lignée cellulaires vu que tu parles aussi de lignée).

sinon tu peux essayer de rajouter du DMSO (10%) et de la bétaïne.
Visiblement pour les PCR qui ont du mal a donner de bons rendements, ca améliore bien le resultat!

YOyo

[invitea74316c7]

Tes contrôles et tes lignées sont des amplifications de même taille? As tu essayé de changer ton materiel de PCR

[inviteffbc6fc3]

Bonsoir, alors dans une même plaque de PCR, j'amplifie à la fois des lignées cellulaires (HT29, HCT116 ...) et des clones (vecteur PGEMt, e.coli, purif avec kit miniprep qiagen ...). Résultats: mes lignées s'amplifient mais pas mes clones. C'est pourquoi je pense que mon protocole n'est pas si mauvais que ça, mes lignées s'amplifient.
J'ai peut-être une idée mais bon: mes vecteurs ont peut-être une forme super enroulée empêchant leur amplification? Je vais tester une enzyme de restriction pour voir si c'est ça ou pas. Qu'en penses-tu?

[inviteffbc6fc3]

Bonsoir, j'ai essayé avec plusieurs tailles et même résultat!

[invitec718404f]

Quelle est ta matrice pour la PCR, de l'ADN ou directement sur les colonies?

[invitec9f0f895]

salut

quelles sont tes conditions de PCR? quelle quantité d'ADN utilises tu?

Yoyo

[inviteffbc6fc3]

Bonsoir, désolée pour le retard. Alors mes clones sont en fait des vecteurs PGEMt dans lesquels j'y ai intégré mon insert. Pour arriver les récupérer après le clonage j'ai utilisé un kit Qiagen miniprep. Puis j'effectue une dilution pour les amener à 1ng/µl. A partir de là je fais ma PCR.

[invitec718404f]

Si j'étais toi j'essaierai une PCR sur colonie pour voir si tu n'as pas de souci avec ton kit... Et franchement ça marche top la plupart du temps et donc économies de temps et d'argent.