Tm mystère des amorces PCR

[inviteabac6f11]

Bonjour,

Je souhaiterai réaliser une PCR multiplex pour identifier en 1 seule manip 3 espèces d'insectes différentes.
[Pour ceux qui ne connaissent pas la PCR multiplex, il s'agit de mélanger à la réaction de PCR, 1 amorce forward genre spécifique (qui se fixe sur l'ADN qq soit l'espèce) et 3 amorces reverse espèces spécifiques.]
Il faut donc que les Tm de ces 4 amorces soient très très similaires. L'amorce F a été prise dans la littérature et est utilisée à 53°C. J'ai dessiné moi-même les 3 amorces R en me cassant la tête pour qu'elles soient entre 51°C et 54°C.
En les commandant sur le site de Sigma, le logiciel me donne les données techniques : mes Tm ne correspondent pas à ce que j'ai calculé grâce au Tm Calculator !!! ()

Consciencieuse, je vérifie sur divers sites de calculs de Tm et il n'y a jamais la même réponse ! Voilà mes amorces, ainsi que les différents Tm :
- Amorce 1 : gcgcttcgaagaagagta (Calcul à la main = 54°C; Tm calculator = 53°C; Sigma = 58°C)
- Amorce 2 : tactgacgtactctccaagc (Calcul à la main = 60°C; Tm calculator = 51°C; Sigma = 57°C)
- Amorce 3 : ctagccccacgtgtaa (Calcul à la main = 50°C; Tm calculator = 49°C; Sigma = 55°C)
Qu'en pensez-vous ? Puis-je utiliser les amorces suivantes dans une même réaction ? A quel calculateur faire confiance ??
Merci pour votre aide !
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[kamor]

[Pour ceux qui ne connaissent pas la PCR multiplex, il s'agit de mélanger à la réaction de PCR, 1 amorce forward genre spécifique (qui se fixe sur l'ADN qq soit l'espèce) et 3 amorces reverse espèces spécifiques.]

Désolé mais on peut aussi mettre des couples d'amorces complets.

Pour le Tm... vaste question. Il y a déjà différentes façons de le calculer.
Il y a celle qu'on nous a appris à la fac. Tm = 4 X(C ou G) + 2(A ou T)
mais elle est fausse. En effet les interactions entre les nucléotides influencent le Tm. Par exemple, un AAAATTTT n'aura pas le même Tm qu'un ATATATAT.
Et donc pour le calculer, chaque programme a sa formule qu'ils modifient au fil des versions. Si je prends en compte le programme que j'utilise pour le design, le thermocycleur qui peut aussi les calculer et le site de commandes, j'ai 3 Tm différents, avec quelques 8°C d'écart
Ah et n'oublions la [MgCl2] qui influe aussi sur le Tm.

[inviteabac6f11]

Merci pour cette réponse Kamor
Pour la petite explication, je décrivais mon cas personnel. Je l'ai un peu tourné comme une généralité.
Pour le Tm... autant de question à son sujet que de calculateurs visiblement :s Je ne me fie que très rarement au calcul à la main, mais là, je ne sais plus qui je dois croire... Le logiciel qui m'aide à définir les amorces ? Le site de commande ? Le calculateur ?
Je vais préciser ma question dans ce cas : puis-je utiliser ensemble, ainsi que je les ai décrites, les 3 amorces précédentes ?

[kamor]

Je voulais juste préciser pour que justement des étudiants ou autre ne le prennent pas en généralité, c'est tout, pas de mal

Je dirais oui pour l'utilisation, le problème après est la température et la spécificité de vos amorces. Si vous avez vraiment des séquences très divergentes, vous n'aurez aucun problème.
Par contre, si vous devez descendre à 49°C, je dirais par mon expérience que vous encourrez le risque d'amplifications aspécifiques. Mais bon, ce genre de choses peut donner des résultats très inattendus, donc je trouve toujours délicat de parier sur ce risque.

Après tout dépend de votre façon de l'utiliser. Perso je crée des multiplex mais sur des bouillons de bactérie où de nombreuses espèces peuvent être présentes, donc les amplifications aspécifiques ou croisées peuvent être assez problématiques.
Je ne connais pas la méthode pour les insectes, si vous prenez des insectes "uniques" dont vous extrayez l'ADN, vous réduisez un peu les possibilités d'ampli aspécifique.

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteabac6f11]

Si vous avez vraiment des séquences très divergentes, vous n'aurez aucun problème.

Mes séquences sont très (très) similaires et ces amorces ont été créées dans les rares régoins qui sont présentes chez une espèce et pas chez les 2 autres. Donc j'ose espèrer qu'elles sont suffisamment spécifiques pour ne se fixer qu'à la séquence voulue (si elle est présente).

Par contre, si vous devez descendre à 49°C, je dirais par mon expérience que vous encourrez le risque d'amplifications aspécifiques.

Je ne descendrais pas si bas. Je ferai un premier essai à 53°C en priant très fort pour que ça fonctionne. Sinon, et bien peut-être 54°C...

Je ne connais pas la méthode pour les insectes, si vous prenez des insectes "uniques" dont vous extrayez l'ADN, vous réduisez un peu les possibilités d'ampli aspécifique.

Je fais de l'identification d'insecte. Je n'ai qu'un seul ADN (inconnu donc) et je cherche à savoir s'il appartient à l'une des 3 espèces ciblées. Je n'ai pas de bouillon, ni de mélanges, donc normalement pas de risques d'amplifications aspécifiques. Mon principal souci demeure dans une hybridation capricieuse des amorces.

Merci de m'avoir confortée dans mon idée Kamor !

[kamor]

Euh si vous avez un risque possible. Votre amorce 3 est celle ayant la plus basse température (même si les écarts sont loins d'être énorme), et la 1 la plus haute.
Donc si vous descendez à celle de l'amorce 3, vous aurez peut être des amplis aspécifiques avec la 1 qui pourra s'apparier un peu n'importe où.
Si vous utilisez celle de l'amorce 1, l'amorce 3 n'arrivera peut être pas à se fixer.

Mais bon, vos conditions peuvent vous simplifier la vie, vous pouvez jouer aussi sur les concentrations de MgCl2 pour favoriser l'un et l'autre.

[inviteabac6f11]

Je me mettrais à la température de l'amorce 2. Coupons la poire en deux
J'espère que ça marchera, même si je dois passer du temps à l'optimisation.
La PCR a ses raisons que la raison ignore. Nous verrons bien.

[kamor]

Si le thermocycleur le permet, faites un gradient de température (ligne A = 60°C... ligne H = 50°C), cette fonction fait gagner un temps fou pour ce genre de petit tracas.

[jmbowie]

Désolé mais on peut aussi mettre des couples d'amorces complets.

Pour le Tm... vaste question. Il y a déjà différentes façons de le calculer.
Il y a celle qu'on nous a appris à la fac. Tm = 4 X(C ou G) + 2(A ou T)
mais elle est fausse. En effet les interactions entre les nucléotides influencent le Tm. Par exemple, un AAAATTTT n'aura pas le même Tm qu'un ATATATAT.
Et donc pour le calculer, chaque programme a sa formule qu'ils modifient au fil des versions. Si je prends en compte le programme que j'utilise pour le design, le thermocycleur qui peut aussi les calculer et le site de commandes, j'ai 3 Tm différents, avec quelques 8°C d'écart
Ah et n'oublions la [MgCl2] qui influe aussi sur le Tm.

Cette formule reste toutefois suffisante pour les oligos classiques de 18-24nt avec un % de GC autour de 50%

[inviteabac6f11]

Si le thermocycleur le permet, faites un gradient de température (ligne A = 60°C... ligne H = 50°C), cette fonction fait gagner un temps fou pour ce genre de petit tracas.

Non malheureusement... Sinon, en effet, ça m'aurait épargné des tracas !

jmbowie : Le problème qui m'était posé était justement lié à cette formule qui ne correspond pas dans un des cas au Tm donné par le site de commande.