Kits d'extraction d'ARNm
Salut tt le monde! qq pourrait m'aider à comprendre le principe des kits d'extractions d'ARNm à partir des tissus végétaux, étape par étape svp? (en fait je n'ai aucune idée sur les kits et je vais les utiliser bientot lors d'un stage), merci bcp
PS: j'ai déjà eu des TP d'extraction traditionnelle (phénol chlorophorme) à partir des feuilles de blé
Bonjour,
De façon succinte, voilà le principe des kits d'extraction d'ARN :
1) lyse des tissus végétaux à l'aide d'une solution stringente (guanidine-isothiocyanate )
2) passage sur des petites colonnes de purification, qui permettent de séparer l'ARN du reste des contaminants (fibres végétales...). Ces colonnes contiennent une petite membrane de silice auxquelles les ARN se fixent spécifiquement. Les autres composés passent à travers la membrane et sont collectés dans un tube collecteur
3) rinçage de la membrane à l'aide d'un tampon spécial ne décrochant pas les ARN, pour éliminer au maximum tout autre contaminant
4) élution à l'eau stérile (c'est le changement de stringence qui provoque le décrochage des ARN de la membrane)
On récupère donc facilement et rapidement les ARN dans un nouveau tube !
Je sais que fut un temps, on pouvait trouver des kits contenant des polyT accroché à la membrane permettant aux polyA en 3' des ARN de rester fixés à la membrane. Mais je ne jurerai pas que toutes les membranes sont ainsi...
PS : voilà un lien vers le site de Qiagen, qui propose un de ces kits. Dans l'onglet "Resources", il y a un lien vers le manuel d'utilisation qui propose un dessin des différentes étapes, ainsi qu'une explication succinte (en anglais bien sûr !)
Bon courage !
Le thiocyanate de guanidium est aussi un inhibiteur de RNase, ces sales petites bêtes étant partout et très efficaces
En fait les kits d'ARN en colonne sont pour la plupart des colonnes qui séparent TOUS les ARN des autres constituants cellulaires. Il y a donc une majorité d'ARNr et des ARNm. Les kits dont tu parles sont très pratiques puisqu'on ne récupère pas les ARNr, en revanche on ne récupère pas non plus les ARNm non polyadenylés, et ça coute beaucoup beaucoup plus cher.Envoyé par Laeti06
Merci pour la précision Flyingbike !
J'ai une question bête suite à ça, comment la colonne fait-elle la différence entre les ADN et les ARN (qui ne doivent pas avoir des propriétés chimiques radicalement différentes) ?
Parfois, je sais qu'on peut faire un traitement à la DNAse mais ce n'est pas toujours le cas...
(Ca éclairera aussi Sarrita307, je pense
Flyingbike a déjà répondu à la question, non ?
Si la colonne est polyadénylée, alors seuls les acides nucléiques simples brin polyU se fixeront dessus ... C'est-à-dire les ARNm (sauf les non polyU+).
Le traitement à la DNAse est une étape supplémentaire, si l'on veut être plus prudent, mais théoriquement la première suffit.
ce que Laeti06 demande, c'est pourquoi les ARN se fixent et pas les ADN.
Eh bien je dirais que c'est un mélange de pH et de salinité qui rend les ARN plus affins que les ADN.
Oui c'était ma question.
Merci pour la réponse. C'est fascinant quand même ce que l'on peut faire avec une petite membrane
Merci bcp tt l monde mnt j'ai les idées plus claires
