Rétrotranscription : Random primers vs Oligo d(T)

[invite10adf645]

Bonjour à tous,
j'ai une question assez simple par rapport à un gros doute sur une manip de qPCR.
J'ai extrait des ARN à partir de différents tissus animaux et réalisé une RT dans le but de quantifier certains gènes en qPCR (SYBR green).
Pour la RT, j'ai utilisé un protocole impliquant un mélange de random primers et d'oligo d(T). Seulement j'ai un doute. Est-ce qu'il ne valait pas mieux n'utiliser que des oligo d(T) pour avoir des cDNA "full length" ? J'ai vu que la rétrotranscriptase s'arretait à chaque primer rencontré, ce qui risque donc de produire pleins de petits fragments pour chaque transcrit dans mon cas.
J'ai peur que cela ne biaise la quantification. Quel est votre avis ?
Pour information j'ai fait migrer mes produits de qPCR (max 130bp) et je ne détecte qu'une seule bande, au bon PM. La courbe de fusion est propre aussi.

Merci de votre aide !!

Fanou
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[invitea74316c7]

Tout ce que je peux te dire c'est que le fait d'utiliser un mix est tout a fait normal et fonctionne parfaitement bien, donc pas de souci. Pour les clonages je n'utilise que des oligo dT qui fournissent donc des séquences complète de mes ARNm. Mais dans ton cas ce n'est pas nécessaire

[invite10adf645]

Merci de ta réponse Montreux !
Si j'ai bien compris, pour la qPCR, on joue sur le fait que les amplicons sont de petite taille par rapport aux ADNc générés et qu'il y aura donc une grande majorité de fragments amplifiables ?

A ce propos, je ne trouve pas d'infos sur la taille moyenne des fragments de RT générés. J'imagine que ça doit dépendre de la concentration en primers... Quelqu'un peut m'éclairer à ce sujet ?

Il y a aussi peut-être le fait que l'utilisation de randoms primers favorise une rétrotranscription complète du pool d'ARN cellulaire (plus efficace), alors que les oligo dT seuls sont utilisés plutôt quand on s'intéresse à la séquence (comme le clonage) et non à la quantité ?