signal southern blot

[invited039bd6b]

Bonjour a tous !

J'espere trouvé de l'aide ici, je commence vraiment a desesperer...
Je réalise des southern blot et depuis plusieurs mois, aucun n'est exploitables.
Les marqueurs de taille sont nickel, par contre le signal de l'ADN d'interet est trop faible pour etre quatifié
J'ai essayé plusieurs chose, changer les kits de marquages ( digoxygenine ), resynthétiser une sonde, changer de fournisseur, refaire tout les tampons, changer les températures d'hybridation ... rien de mieu !!

Mais j'ai tendance a penser que le probleme vient du marquage ou de la sonde ADN.
Il y a quelques semaines j'ai coupé ma membrane en deux, j'ai hybridé la premiere partie avec un ancien tampon+sonde avec lequel j'avais obtenu de bon résultat .. et la deuxieme moitié avec le tampon et les sondes que j'utilise ces derniers moi ..
La premiere partie est exploitable, la deuxieme ne l'est pas !

Mais je n'arrive quand meme pas a améliorer mon signal ..

Si vous avez des suggestions c'est avec plaisir que je les lirais
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[invite3c235e37]

Bonsoir.
Je n'ai jamais fait de southern, mais j'ai fais pas mal de northern. Ne peux tu pas déposer plus d'ADN? Ou augmenter le temps d'exposition?

[invited039bd6b]

Non je ne peux pas augmenter les quantités d'ADN, je suis déjà a 3µg et la méthode marchait trés bien avec ces quantités il y a quelques mois. Le probleme ne vient pas des ADN j'en suis sure..

Et l'augmentation du temps d'exposition n'a pour effet que l'augmentation du background

[invited039bd6b]

personne pour m'aider ??

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

salut

tu as l'air d'utiliser des sondes froides, peux tu essayer en P32 ou P33?

Est-ce que tu peux prendre une sonde plus grande?

YOyo

[invited039bd6b]

Je ne peux pas utiliser de radioactivité ..
et jusque la le marquage par la digoxigenine fonctionnait trés bien.
Il ne m'est pas non plus possible de d'augmenter la taille de la sonde.

Le protocole que j'utilise donnait d'excellent resultats.. Mais il y a un paramétre que je ne maitrise pas et qui doit interferrer.

[invitec9f0f895]

Salut

Bon ben la seule solution est que tu refasses tous les tampons de A à Z et tu verras bien ce que ca donne.

YOyo

[invited039bd6b]

J'ai deja changé tout mes tampons sans succés

[invite853321bf]

A ta place (si tu peux), je referai ton expérience ancien-nouveau matériel, mais en mettant
nouveau tampon - ancienne sonde, et ancien tampon - nouvelle sonde de l'autre côté.
Ainsi tu pourrais voir si ton problème est liée à la sonde ou au tampon.
Es tu sur que la séquence de ta sonde est bonne ? J'ai déjà eu des surprises en commandant des amorces ou sonde. Mauvais copier coller, oubli, etc. Les causes d'erreur sont nombreuses.

[invited039bd6b]

C'est une bonne idée !! l'ennui est que je n'ai plus de l'ancienne sonde..
Je vais demander a une equipe américaine de m'envoyer une petite quantité de la sonde qu'ils utilisent, marquée et à marquer.
Cette sonde la je sais qu'elle fonctionne. Si je n'ai pas de bons resultats avec celle qu'ils auront marqué, c'est que ca vient de mon tampon ... mais quoi dans le tampon aprés ?? il a aussi ete refait plusieurs foi !
Ma séquence devrait etre la bonne, je l'ai faite synthétisée de nombreuse fois depuis que j'ai des soucis, je ne pense pas qu'une erreur ce soit repétée a chaque foi ..

Par contre pensez vous qu'inserer un sonde antisens puisse augmenter mon signal ?