coloration nitrate argent

[invite34a4c75d]

Bonjour à tous,

je viens chercher de l'aide pour un problème de coloration au nitrate d'argent. J'essais de valider un protocole de coloration au nitrate d'argent donc, pour colorer des protéines sur un gel d'agarose.

J'ai essayer plusieurs protocoles (qui se recoupent tous plus ou moins, donc je pense qu'au niveau des réactifs utilisés ça doit être bon), mais je pense pense qu'ils sont tous utilisés pour la coloration de gel de polyacrylamide. Et pour information, j'utilise de l'eau MilliQ, comme largement recommandé.

Mon problème est que je ne visualise pas mes protéines, je vois juste monter le bruit de fond sur le gel. (étant en phase de test je fait migrer de la BSA, et la partie éléctro en elle-même a été validée par coloration au bleu de coomassie)
J'ai déjà essayer de sécher mon gel, soit sous presse soit au four à 40°C, mais sans amélioration.

Quelqu'un aurait-il déjà testé cette coloration dans ces conditions?
Auriez-vous un conseil, quelque chose que j'oublierais de faire?
A défault, quelqu'un connaitrait-il une autre coloration sur gel ou membrane, plus sensible que le bleu de coomassie? (je souhaiterais éviter l'immunodétection, pour des raisons économiques…)

Merci d'avance pour votre aide
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[Flyingbike]

deja, pourquoi vouloir utiliser de l'agarose ?

[Edelweiss68]

La révélation des protéines par le nitrate d'argent sur gel d'agarose est apparemment possible (http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=3248811), il reste à savoir si vous utilisez effectivement le bon protocole.

[invite34a4c75d]

Je dois utiliser de l'agarose car je vais faire migrer mes protéines avec des glycosaminoglycanes pour lesquels l'électrophorèse doit se faire sur gel d'agarose. Sinon, je serais déjà passé sur polyacrylamide

Pour le protocole, les différents protocoles que j'ai comparé utilisent tous grosso modo les mêmes composants, les mêmes grandes étapes et les mêmes temps d'incubation. Donc j'aurais tendance à penser qu'il y a quelque chose à faire en plus pour l'agarose.
J'essaie d'avoir l'article cité, afin de voir leur protocole.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Edelweiss68]

Peut-être s'agit-il d'un problème au niveau de la concentration de vos protéines.

Cependant les concentrations en protéines supérieures à 2 ng/mm² provoquent généralement la saturation des images à l'argent

https://iris.univ-lille1.fr/dspace/b...2004-87-88.pdf

[invite34a4c75d]

Hum, je ne l'avais pas envisagé. Cependant, je réalise une gamme de BSA de 20µg à 0,05µg, donc je pense que pour les points les plus bas de ma gamme, je ne devrais pas être confrontée à ce problème.

[invitebc55bbf9]

salut,
comme autre coloration que le bleu de coomassie y a par exemple le bleu colloidal qui est plus sensible que le bleu de coomassie classique et aussi le sypro ruby encore plus sensible. Pour ce dernier par contre la détection est moins évidente. Ca se fait sur une table UV par exemple (quand je l'avais utilisé j'avais la chance de pouvoir utiliser un appareil typhoon pour la détection). Par contre aucune idée de la compatibilité avec l'agarose.
salut

[invite34a4c75d]

OK merci pour l'info bubux, je vais me renseigner pour le bleu colloïdal et la compatibilité pour l'agarose, je ne dispose malheureusement pas de table UV…

[invitebc55bbf9]

re salut,
sinon ça à l'air très très complet la dedans.

Electrophoretic approaches to the analysis of complex polysaccharides
Journal of Chromatography B
Volume 834, Issues 1-2, 13 April 2006, Pages 1-13

Pour l'agarose ils mentionnent des protocoles avec de l'azur A ou alors du toluidine blue.
a+

[invite34a4c75d]

C'est gentil, j'ai déjà lu ce papier mais ce ne sont pas des colorations pour les protéines dans un gel d'agarose malheureusement.

[invitec718404f]

Je te conseille le kit Bio-rad, je l'utilise souvent et il fonctionne bien. je crois qu'il marche aussi sur agarose en plus (désolé la flemme d'aller vérifier au labo...)!