Bonjour,
Je suis en train de mettre au point un dosage d'anticorps par technique elisa. J'utilise des peptides (trentaine d'AA) qui sont biotinylés et coatés sur des plaques streptavidine (Pierce) qui sont prébloquées au superblock. Le coating se fait par incubation d'1h des peptides biotinylés (dilués en PBS) dans les puits des plaques revêtus de streptavidine. Ensuite on fait 3 lavages, puis on incube le sérum de patient dilué au 1/100 en PBS/BSA 0.05%/tween 0.05% 1h à 37°C, suivi de 3 lavages. La dernière étape est l'incubation avec un anti-human IgG-PAL, puis révélation au pNPP.
Le problème rencontré est un bruit de fond encore trop élevé lorsque le sérum est incubé dans les puits revêtus de streptavidine mais non coatés avec le peptide (DO entre 0.35 et 0.45 selon les échnatillons). Pourtant ces puits sont prébloqués au superblock par Pierce lors de la fabrication des plaques. Je pense que le superblock ne bloque pas suffisamment la fixation des anticorps non spécifiques du sérum (je n'ai pas d'accrochage du conjugués, je l'ai vérifié). J'ai essayé d'ajouter une étape de bloquage en PBS + BSA1% 1h +37°C après le coating des peptides biotinylés mais cela a complètement inhibé la signal spécifique aussi. Je précise que j'ai utilisé de la BSA protease free pour éviter le "grignotage" des peptides.
Peut être que la BSA est trop grosse pour saturer des puits coatés avec des peptides d'une trentaine d'AA et du coup gêne la reconnaissance des peptides par les anticorps du sérum ?
quel type de bloqueurs me recommanderiez vous de tester ? à quelle concentration? vaut il mieux bloquer après coating du peptide biotinylé ou avant ?
Sinon j'ai essayé de bloquer via le diluant du sérum en mettant du Régilait à 1% mais cela m'inhibe complètement le signal spécifique aussi. Je n'ai aps d'explication à cela. Mais peut être vaut il mieux bloquer au niveau de la plaque ?
Merci pour votre aide!!!!
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