Précipitation protéines au sulfate d'ammonium

[invite78367254]

Bonjour

j'aurais quelques questions pratiques au sujet d'un protocole d'extraction que j'ai lu sur un article scientifique.

Ma protéine a été exprimée chez S. cerevisiae. Les cellules vont être lysées mécaniquement. Puis une première étape de précipitation va être réalisée à l'aide du sulfate de protamine (stock à 3% w/v pour être à 0,07% final) pour je suppose éliminer les acides nucléiques, ... Après une étape de centrifugation, ma protéine va être précipité entre 35 et 45 % de sulfate d'ammonium (100%) puis on réalise une nouvelle étape de centrifugation et le culot est resolubilisé.

Voici mes questions:

- Mes solutions stocks de sulfate de protamine et de sulfate d'ammonium doivent elles être préparées dans de l'eau ou dans mon tampon d'extraction (important, il contient 20% de glycérol qui doit largement modifié la solubilité des deux sels précédents)? J'ai tenté de préparé le sulfate de protamine dans le tampon et j'ai de gros problèmes de solubilité. Je me dis qu'il faut certainement le préparer dans l'eau mais du coup, je fais diluer le tampon d'extraction de ma protéine. Dans la publication, les auteurs ne spécifient rien. Pourriez vous m'éclairer svp?

- Autre question, dans quoi vous faites la précipitation. Je suppose dans des tubes résistants à une force centrifuge élevée. Pourriez vous me le confirmer svp?

Merci par avance

Fabien
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[invite02cefc91]

Bonjour,

Effectivement, à ta place, je diluerai les solutions stocks dans de l'eau. Il suffit juste que tu adaptes leur concentration pour qu'in fine tu obtiens la bonne concentration finale dans ton tampon d'extraction.
Pour la précipitation, tout dépend du volume que tu veux extraire, des eppendorfs 1.5 ml/2ml ou des tubes falcons sur tu as des volumes plus importants...

[invite78367254]

Merci pour votre aide