enzyme de restriction Hin1II

[invite8e78b981]

bonjour à tous

je suis une étudiante en première année de thèse et j'ai un problème avec la détection d'un polymorphisme au niveau du promoteur IGF1 rs35767 par RFLP . j'ai utilisé l'enzyme de restriction Hin1II ou appelé aussi NLaIII mais j'ai eu une digestion dans tous les individus que j'ai testé alors que la mutation est rare dans la population caucasienne et elle est seulement de 10%. Est ce que cette enzyme est n'est pas suffisamment spécifique ?
quelqu'un a eu ce problème ?
Merci beaucoup
-----

[piwi]

Je ne connais pas particulièrement cette enzyme, mais en pêchant des infos sur le site NEB, il semblerait qu'elle ne soit pas stable. Ceci explique peut être votre problème avec l'apparition de coupures aspécifiques. Votre lot est-il ancien?

piwi

[invite8e78b981]

bonjour,
Merci pour votre réponse mais l'enzyme n'est pas ancien il neuf : lot 00089712 et Expiry date est 05/2013 . je l'ai acheté chez fermentas.
Que pensez vous de ça ?

[invitea74316c7]

Avez vous essayé de diminuer la température, par exemple à 16°C afin d'éviter des coupures non spécifiques? Il faut peut etre également utiliser un buffer diminuant l'activité de l'enzyme afin d'éviter des coupures non spécifiques!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8e78b981]

non la température d'incubation est 37°C est celle recommandé par le protocole et que je l'ai retrouvé aussi dans la biblio mais dans un autre
gène . et j'ai pas utilisé autres tampons .
Merci pour la réponse

[invitea74316c7]

16°c n'est pas la température recommandée mais cela permet de diminuer l'activité non spécifique de l'enzyme. J'ai déja travaillé de cette manière pour effectuer des digestions partielles ou encore des digestions relativement difficiles!

[invite8e78b981]

bonjour,

vous me proposez quoi comme tampon diminuant l'activité non spécifique?
Merci

[invitea74316c7]

Eh bien chez NEB vous avez 4 buffers à choix et comme vous pouvez le voir sur le site, seul le 4 propose une activité à 100% donc n'importe lequel des deux autres!