bonjour!!
j'ai du mal à comprendre une notion de mon cours malgré les explications de ma prof : pourquoi l'ADN du plasmide et celui de l'organisme dont on veut cloner le géne sont-ils découpés avec la même enzyme de restriction?
merci d'avance si vous avez une explication à me proposer!!
ça a l'air logique, mais si je dit une bêtise, un membre plus confirmé pourrait me corriger? Merci!
Sur le plasmide existe le polylinker, composé de sites de restriction uniques mis bout à bout.
On prélève l'insert (le gène à cloner) grace a une enzyme de restriction qui va cliver l'ADN sur des sites de restriction spécifique (c'est une séquence palindromique). On peut ensuite amplifier l'insert par PCR; puis l'insérer dans le polylinker avec une ligase.
Si on utilise la même enzyme de restriction pour le vecteur et l'insert, on aura le site de restriction du vecteur qui va correspondre aux extrèmités débordantes de l'insert, donc celui-ci pourra s'hybrider facilement avec le vecteur.
Salut
c'est a peut pres ca, sauf que si tu fais une etape de PCR c'est le produit de PCR que tu digeres directement, pas le plasmide. Tu ne peux pas cloner un gène par restriction directement a partir de l'ADN genomique.
Yoyo
Attend une seconde Yoyo, je ne te suis pas (comme je disais a MaliciaR, je suis long a la détente).
On va d'abord amplifier la séquence d'intérêt par PCR, puis la digérer avec l'enzyme de restriction?
Je ne comprend pas, on a toujours besoin de l'enzyme de restriction pour ouvrir le plasmide et y mettre l'insert, non?c'est a peut pres ca, sauf que si tu fais une etape de PCR c'est le produit de PCR que tu digeres directement, pas le plasmide
L'étape d'amplification est nécéssaire car on ne peut travailler en dessous d'une certaine concentration d'insert?Tu ne peux pas cloner un gène par restriction directement a partir de l'ADN genomique.
Il est très possible de cloner un fragment d'ADN génomique amplifié par PCR dans un plasmide extrait mais non amplifié, mais il est préférable de déterminer la concentration approximative disponible de ces 2 olécules avant de les utiliser.Envoyé par Thibauld
Attend une seconde Yoyo, je ne te suis pas (comme je disais a MaliciaR, je suis long a la détente
On va d'abord amplifier la séquence d'intérêt par PCR, puis la digérer avec l'enzyme de restriction?
Je ne comprend pas, on a toujours besoin de l'enzyme de restriction pour ouvrir le plasmide et y mettre l'insert, non?
L'étape d'amplification est nécéssaire car on ne peut travailler en dessous d'une certaine concentration d'insert?
Oui c'est caAttend une seconde Yoyo, je ne te suis pas (comme je disais a MaliciaR, je suis long a la détente
On va d'abord amplifier la séquence d'intérêt par PCR, puis la digérer avec l'enzyme de restriction?
Oui mais je pensais au cas ou ton insert etait deja dans un plasmide... bref oui il faut bien ouvrir le plasmide avant d'y mettre l'insert.Je ne comprend pas, on a toujours besoin de l'enzyme de restriction pour ouvrir le plasmide et y mettre l'insert, non?
ce n'est pas qu'une question de quantité... mais imagine ce que tu vas avoir si tu coupes ton ADNg par une enzyme de restriction genre EcoRI...
L'étape d'amplification est nécéssaire car on ne peut travailler en dessous d'une certaine concentration d'insert?
YOyo
Salut,
Pour reprendre l'explication de Yoyo, tu veux avoir un gène d'intérêt que tu clones dans un plsamide.
Sauf que l'ADN génomique que tu fragmentes n'est pas constitué d'ORF à 100%, bien au contraire... Donc, pour que j'aie la séquence codante d'un gène qui m'intéresse je fais une PCR : les amplicons résultants seront des séquences codantes sans "parasites" non codants.
Tu fais une PCR après la ligation pour vérifier que l'insert est bien le gène qui t'intéresse
Avec la Levure, tu peux cloner directement à partir de 'ADN génomique parce que dans son cas il y a 76% du génome qui est codant... contre 1 à 2% pour les Mammifères...
En tout cas, c'est ce que l'on nous raconte en cours et en TP. Mais comme j'ai eu le cerveau frit à cause du mauvais temps dehors, il y a des chances que je raconte des bêtises... Donc, correction bienvenue
Cordialement,
c'est vrai en ce qui concerne la levure et les sequences codantes, maintenant c'est irréaliste!
si tu coupes ton ADNg de levure par une enzyme de restriction tu vas avoir des milliers (voir des centaines de milliers) de fragments. Tu vas les cloner tous un part un pour trouver le bon?....ben non
Donc on en reviens a ce que je disais le clonage direct par restriction de l'ADNg cela s'appelle faire une banque d'ADNg mais ce n'est certainement pas fait pour cloner un gène spécifique.
Yoyo
Oui, c'est bien ce qui me chiffonait dans mon cours aussi... Je veux dire, si je prends EcoRI et que je digère, je vais me retrouver avec un tas de fragments inutilisables... En fait, on fait une banque quand on veut trouver un gène qu'on ne connaît pas, on connaît juste un phénotype mutant qu'il provoque.c'est vrai en ce qui concerne la levure et les sequences codantes, maintenant c'est irréaliste!
si tu coupes ton ADNg de levure par une enzyme de restriction tu vas avoir des milliers (voir des centaines de milliers) de fragments. Tu vas les cloner tous un part un pour trouver le bon?....ben non
Donc on en reviens a ce que je disais le clonage direct par restriction de l'ADNg cela s'appelle faire une banque d'ADNg mais ce n'est certainement pas fait pour cloner un gène spécifique.
Yoyo
Mais parfois on nous parle de digestion incomplète, sans nous préciser comment. Donc, j'en profite pour poser ma petite question
Merci
Mes professeurs appelaient ça "digestion ménagée". Je crois qu'on utilise un chélateur d'ions divalents pour limiter l'action des enzymes de restriction ( EDTA dans le cas des endonucléases, qui va chélater le Mg2+ dont ces enzymes ont besoin pour fonctionner).
Merci pour vos réponses. Si on laisse agir EcoR1 sur l'ADNg on obtient un grand bol de vermicelles!
salut
pour les digestions ménagées il y a plusieurs techniques:
-soit on se met en quantité limitante d'enzyme.
-soit on rajoute du BET dans la digestion. il va s'intercaller a la premiere coupure et empechera l'enzyme de recouper. Mais c'est vrai pour les plasmides je n'ai jamais essayé pour de l'ADNg.
Yoyo
Je rebondis sur ce que tu dis parce que l'on m'a toujours dit que le BET posait un problème pour les clonages ultérieurs. Vu que tu sembles en avoir l'expérience, est ce que tu pourrais me dire si cette croyance est vraie ou pas?
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Personnellement je n'ai jamais eut de probleme, mais je passe par une etape de purification sur colone ce qui me permet probablement de m'en debarasser (de la meme maniere que les fragments d'ADN clonés apres migration sur un gel d'agarose+BET. Ceci dit, il en faut vraiment pas bcp, car meme a tres faible concentration ca inhibe tres fort la digestion.
Yoyo
