enzyme de restriction BsaHI

[invite4b7d549c]

Bonjour à tous,

Je voulais utiliser l'enzyme de restriction BsaHI.
Y en a t-il parmis vous qui l'on déjà utilisé.

J'ai essayé selon le protocole suivant :
15 µl H20 stérile
2 µl ADN 1µg
2 µl tampon 10 X (tampon spécial pour l'enzyme)
1 µl de l'enzyme

Sans résultat.

Je ne trouve pas de protocole pour cette enzyme.

Merci d'avance
-----

[inviteffc67642]

Bonjour (soir),

J'ai une ou deux questions:
- combien de temps as tu digéré? (une surdigestion de 10x est conseillée sur le catalogue)
- as tu fait attention aux ilôts CpG et à la méthylation dcm dans ta séquence? (
Je l'ai utilisée, et je n'ai pas eu de problèmes...

El.

[invitee8b3f97e]

Salut !

- la température d'incubation était elle bien de 37°C ?
- combien de temps as tu laissé incuber ?
- as tu rajouté de la BSA (bovine serum albumin) dans ton mix, ou y'en a t'il déjà dans le mix ?
- qu'essayes tu de digérer ? amplicons de PCR, génome entier (de quel organisme ?)

[invite4b7d549c]

Rebonjour,

J'avais pas précisé, j'ai fait ma réaction 1 h à 37°C. Mais je n'ai pas mis de BSA et il n'y en a pas dans le mix. C'est vraiment important la BSA ? ça fait quoi en faite ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

Salut

sur le catalogue de NEB ils indiquent qu'une incubation a 60°C augmente de 2x l'activité de l'enzyme.
http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0556.asp

En revanche il faut absolument que ta souche de coli soit dcm- sinon ton site de restriction est resistant a la coupure. Je pense que ton probleme de digestion viens de la.
a lire si tu veux en savoir plus sur le systeme dam/dcm methylase.
http://www.neb.com/nebecomm/tech_ref...s_of_ecoli.asp

Yoyo