Besoin d'aide dans l'identification d'une molécule !

[invite503917e8]

Bonjour,
Je cherche un résoudre un problème à partir des résultats d'un western blot. J'aurais bien aimé vous scanner ça mais j'ai des petits problèmes techniques donc je vais vous le décrire !
On fait donc un western blot avec un lysat de cellules en cultures.
On a produit un anticorps dirigé contre un facteur de croissance (GF).
On utilise bien sur un anticorps secondaire pour le repérer.

Dans la 1ère configuration, il n'y a ni Anticorps primaire (anti GF), ni anticorps secondaire. Aucune bande n'apparaît (logique).
Dans la 2ème configuration, il n'y a que l'anticorps secondaire. Une bande apparaît à 100kDa.
Dans la 3ème configuration il n'y a que l'anticorps primaire. Aucune bande n'apparaît (je suis d'accord, il n'est pas repérable sans l'anticorps secondaire).
Dans la 4ème configuration, il y a l'anticorps primaire ET l'anticorps secondaire. Il y a:
-une bande à 100kDa (celle là on la connaît)
-Une bande vers 170kDa (je pense au récepteur de l'EGF, de toute façon qu'on le reconnaisse ou pas le poids correspond au poids d'un récepteur)
-une bande à 50kDa : c'est mon problème. Que diable vient-elle faire là ?! Si on la voit c'est que l'anticorps secondaire se fixe dessus. Mais l'anticorps secondaire est sensé se fixer sur l'anticorps primaire lui même sensé se fixer sur...le récepteur !

Les 2 bandes ne peuvent pas correspondre au récepteur ! Si ?! Bref j'ai besoin d'aide...Merci d'avance.
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[invite503917e8]

Hmm je vois que mon problème n'inspire personne ? Peut-être que je ne m'exprime pas clairement ?
Si vous ne trouvez pas LA réponse, ce n'est pas grave je cherche juste à discuter de cela...En tout cas vous serez d'accord pour dire qu'il est impossible que la bande à 50kDa corresponde EGALEMENT au récepteur n'est-ce pas ?

[azizovsky]

salut , j'ai rien compris dans les données némurique , je pense que la bande représente l'éxés d'anticorps primaire sur lequel est fixé l'anticops secondaire( apparence de la bande) ,il y'a saturation des récepteurs d'anticorps primaire où se fixe le secondiare ,faire une autre manip avec les deux anticorps seulement et l'emplacement de la bande de leur réaction peut confirmer ou .. mon hypothése .

[azizovsky]

c'est pas possible que l'anticops secondaire tous seul se trouve à 100 kDA ET va se trouver à la même place quand t'il est fixé au anticops primaire (question de logique) .

[A voir en vidéo sur Futura]

[vpharmaco]

-une bande à 50kDa : c'est mon problème. Que diable vient-elle faire là ?! Si on la voit c'est que l'anticorps secondaire se fixe dessus. Mais l'anticorps secondaire est sensé se fixer sur l'anticorps primaire lui même sensé se fixer sur...le récepteur !

Hum... Ca c'est le cas idéal ou tu as un anticorps primaire ultra-selectif qui ne va reconnaitre que ta protéine d’intérêt.
Ca marche plutot bien pour les protéines qui interessent beaucoup de personnes dans le monde. Mais, des lors que tu t'interesses a une protéine un peu originale, pour laquelle peu d'anticorps ont ete produits, il n'est pas rare de trouver des anticorps peu specifiques, qui vont pouvoir se lier egalement a des proteines autres que celle qui nous interesse. En tout cas, c'est ma premiere hypothese. Peux tu tester d'autres lots d'anticorps primaires diriges contre ta proteine ?

[invite503917e8]

Merci de vos réponses !
En fait c'est pas un western blot mené par mes soins mais par une équipe de chercheurs...et mon prof de biocell en a fait issu d'un exercice à QCM. Le genre d'exos qui nécessite de BIEN comprendre l'énoncé avant de se lancer pour tenter de répondre aux questions...et l'on nous demande d'être très logiques ce qui n'est pas toujours facile car le manque d'expérience dans ce domaine ne nous rend pas très surs de nous !

Bref, l'hypothèse de l'anticorps peu spécifique me plaît bien...
Mais il y a un gros problème : puisque l'anticorps secondaire tout seul pèse 100kDa, il ne peut pas se trouver avec ou sans une autre protéine à 50kDa !
En plus le prof n'a jamais fait mention de cette notion de spécificité d'anticorps auparavant, pour simplifier les choses...donc on n'est pas sensé y penser tout seul (enfin je crois!)

Donc soit c'est un piège du prof (hmm pas simpa mais en même temps je le sens capable de nous faire le coup )
Soit cet anticorps de malheur s'est séparé en deux ?

Bref je sens que je vais abandonner la question, pour me consacrer à la révision du reste de mes cours...

[Flyingbike]

ou alors c'est simplement qu'on n'est pas en conditions dénaturantes (obligé vu qu'on s'attend a détecter le facteur de croissance lié a quelque chose) donc on détecte simplement plusieurs choses, comme le récepteur, le facteur lui meme, etc...

[invite4ab31fa6]

Bonsoir,

Cela pourrait aussi être un produit de dégradation de ta protéine d’intérêt, qui contient l'épitope ciblé par ton anticorps primaire.

Cordialement Fifikz

[azizovsky]

salut , mnt que je sais la signification des unités KDA , mon hypothése doit toujour être vérifier , possible qu'il n'y pas une simple réaction biochimique de liaison (anti-corps primaire et secondaire) mais aussi une autre réaction biochimique de décomposition des molécules réactivent en même temps ce qui réduit la masse moléculaire à 50 kDA , en plus les récepteurs + anticorps primaire +anticops secondaire(100kda) pésent 170 kda me parrait peu:càd anticorps paimaire+récépteurs=70??,il doit avoir une réaction de décomposition entre .... ,le récepteur tout seul pése seulement 120KDA?

[inviteae6c05c4]

Bonsoir,

Je ne comprends pas pourquoi vous avez un signal avec l'anticorps secondaire seul, c'est anormal.

Ensuite, vous nous parlez dans l'énoncé d'anticorps dirigé contre un facteur de croissance, puis dans les résultats, vous parlez du récepteur. Finalement, on cherche a détecter le facteur ou son récepteur ?

Enfin, même si tout cela est un peu flou, avez-vous pensé à une forme multimérique ?

[invite503917e8]

On détecte le facteur de croissance grâce à l'anticorps primaire, mais il s'est forcément fixé au récepteur en fait. Donc au final c'est le récepteur qu'on détecte.
Un récepteur multimérique ? Oui j'y ai pensé, mais ça semble bizarre car 50 et 170 ne sont pas des multiples !

En fait nous ne trouverons jamais la réponse grâce à ce seul western blot ! Nous ne pouvons que supposer. J'essaierai de me renseigner sur le fin mot de l'histoire et puis je vous viendrai vous dire à tous ce qu'était la fameuse bande !

[Flyingbike]

on peut faire des dizaines d'hypothèses sans savoir plus sur les conditions expérimentales. On ne peut pas partir du principe qu'on détecte le récepteur. S'il y a du GF libre, on le détecte aussi. La bande avec le secondaire seule peut très bien être des IgG, puisque le secondaire reconnait les IgG.