Problème immunofluo

[invitef3e75b60]

Bonjour,

quelqu'un aurait de l'expérience en IF? voici mon problème : j'ai jusqu'à présent travaillé avec des cellules vivantes en fusion GFP. Désormais je dois faire des IF sur cellules fixées. Pas de problèmes pour un marquage de la tubuline (avec des anticorps) ou pour un marquage actine (avec de la phalloidine), mais pas moyen d'avoir un signal avec ma protéine d'intérêt. L'anticorps marche bien en WB et la personne ayant précédemment travaillé dessus avait un signal qui semblait cracher à fond. J'ai suivi son protocole à la lettre mais pas moyen? Pourrais-il y avoir un problème avec l'anticorps secondaire?

Merci d'avance!!
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[v_711]

Quel type de fixation utilises-tu ?
Une fixation trop agressive peut dénaturer un épitope au point que l'anticorps ne soit plus capable de le reconnaitre.
La fixation que tu utilises a-t-elle déjà été décrite avec ton anticorps primaire ?

De quel type de protéine s'agit-il ?
Pour exemple : les protéines nucléaires nécessitent une étape de perméabilisation plus agressive que les protéines cytoplasmiques.

Dis-nous en un peu plus sur ta manip (but et protocole)...

[invitef3e75b60]

fixation à la PFA, je n'utilise pas de méthanol étant donné que ma protéine pourrait avoir un lien avec le cytosquelette et il me semble que la fixation méthanol n'est pas top pour le cytosquelette... j'ai testé avec ou sans permeabilisation avec du triton, blocage lait ou blocage serum ou pas de blocage. L'anticorps primaire est un anticorps que nous avons fait faire donc rien n'est décrit par rapport à celui ci, en plus il n'est pas purifié, est-ce que cela pourrait jouer?
c'est une "nouvelle" protéine, je voudrais simplement pouvoir la localiser

[Flyingbike]

sur le tissu fixé c'est aussi une protéine de fusion ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef3e75b60]

sur cellules humaines, la protéine est surexprimée mais il n'y a ni tag ni GFP