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PCR - Calcul du nombre de cycles



  1. #1
    helo62

    PCR - Calcul du nombre de cycles


    ------

    Bonjour, voici une question toute simple, mais je n'arrive pas à trouver la réponse.
    Il faut calculer le nombre de cycles théoriquement nécessaire pour obtenir 1 microgramme d'un fragment d'ADN (2001 bases) en partant de 10ng d'ADN de taille 1 milliard de pb (MMpb =660 Da)

    je fais un produit en croix:

    660 x 10^9 <-> 1 mol
    10 x 10^-9 <-> 1,5 x 10^-20 mol

    mais je ne vois pas après cmt en déduire le nb de cycles...

    Si quelqu'un pouvait m'aider svp, j'ai un exam bientot.

    Merci!

    -----

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  3. #2
    AstroBax

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    Bonjour,

    Je partirais du principe qu'un microgramme représente Da. Avec un amplicon de 2001 pb qui fait Da, on peut calculer le nombre de cycles nécessaires pour arriver à 1 microgramme si on commençait avec un seul template. Après, il suffit de trouver encore combien de templates on a dans notre échantillon de départ avec le fait qu'on a 10 ng d'ADN de 1 milliard de pb.

    C'est pas la méthode la plus rigoureuse, mais ça devrait marcher...
    La science ne sert guère qu'à nous donner une idée de l'étendue de notre ignorance.

  4. #3
    Flyingbike

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    c'est simple mais combien avons nous de copies dans la matrice ?

  5. #4
    helo62

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    Merci pour vos reps!
    Je poste l'exercice en entier, je pense qu'en fait la dernière question dépend des autres, et jai du me tromper aux premieres. on a cette sequence:

    1 ttttaagtta ctgtgtgctt gttgcaggat ctgtaactaa ttcctatgcg attctcttgt
    61 ttgtagggcg aagatgaggg agatcctgca catccaggga gggcaatgtg gcaaccagat
    121 tggcgccaag ttctgggagg tggtgtgcga tgaacatggc attgacccta ccgggcggta
    181 cactggcaat tccgaccttc agttggagcg tgttaatgtc tactacaatg aagcctcctg
    241 cggacgcttt gttccccgcg ctgttctcat ggatcttgag cctgggacaa tggacagtgt
    301 ccggaccgga ccctatgggc agatcttccg ccctgacaac tttgtgtttg ggcaatctgg
    361 tgctggtaac aattgggcta agggccacta caccgagggt gctgagctca ttgactctgt
    421 tctggatgtt gtgaggaagg aagctgagaa ctgtgactgc ttgcaaggat tccaagtatg
    481 ccactccctt ggtggtggta ctggatctgg tatgggtacg ctgttgatct caaagatcag
    541 ggaagagtac cctgaccgca tgatgcttac attctcagtt ttcccctcac cgaaagtatc
    601 tgataccgtg gttgagccat acaatgccac tctttctgtc caccagttgg tcgagaatgc
    661 tgatgagtgc atggttctcg ataacgaagc cctctatgac atctgcttca ggactcttaa
    721 gctgaccacc cctagctttg gtgatctgaa ccatttgatc tctgcaacca tgagtggagt
    781 cacctgctgc ctaaggttcc ctggtcagct gaactccgac ctcaggaagc tggcagtgaa
    841 cctgatcccc ttcccccgtc tccacttctt catggtcggc ttcgcgccgc tgacgtcccg
    901 tggctcccag cagtaccggg ccctcacagt ccccgagctc acgcagcaga tgtgggatgc
    961 caagaacatg atgtgtgccg ctgaccctcg ccatgggcgt tacctcaccg cctcggccat
    1021 gttccgcggg aagatgagca ccaaggaggt tgacgagcag atgatcaacg tccagaacaa
    1081 gaactcgtcc tacttcgtgg

    1. Déterminer la séquence des deux amorces (20 nucléotides) utilisables pour obtenir
    l’amplification de la séquence présentée en gras.
    2. Calculer la température de fusion (Tm) de chacune de ces deux amorces.
    3. Proposer un protocole d’amplification (température et durée des différentes étapes sachant que
    la vitesse de la Taq polymérase est d’environ 1 kb/min).


    4. Calculer le nombre de cycles théoriquement nécessaire pour obtenir 1 µg de ce fragment en
    partant de 10 ng d’ADN génomique d’une taille de 1 milliard de pb (MMpb = 660 Da).

    Pour la 1ere question, on peut choisir n'importe quelle amorce qui encadre la séquence en gras? Et chacune ( REV et FWD) doit faire 10 nucléotides?
    Pour la 4eme question, du coup je ne sais pas s'il faut amplifier juste le fragment qu'on obtient avec les amorces ou toute la sequence présentée...
    Qu'en pensez vous?

  6. #5
    Flyingbike

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    1) non pas n'importe laquelle, il faut que les deux amorces (20 CHACUNE) ne soient pas complémentaires, aient un Tm similaire, une proportion de G/C similaire et entre 40 et 60% idéalement, etc.
    Pour la 4, on amplifie ce qu'il y a entre les amorces. Commences par calculer quelle est la masse de ta séquence en gras dans tes 10ng de départ, connaissant la taille de la matrice et la taille de ton fragment.

    Ensuite, vu que tu sais comment se comporte la quantité d'ADN a chaque cycle d'amplification, il suffit de calculer le nombre de cycles pour arriver a 1µg.

    PS : si tu nous mettais la séquence en gras, en gras ?

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    helo62

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    heu oui pardon, voilà :

    1 ttttaagtta ctgtgtgctt gttgcaggat ctgtaactaa ttcctatgcg attctcttgt
    61 ttgtagggcg aagatgaggg agatcctgca catccaggga gggcaatgtg gcaaccagat
    121 tggcgccaag ttctgggagg tggtgtgcga tgaacatggc attgacccta ccgggcggta
    181 cactggcaat tccgaccttc agttggagcg tgttaatgtc tactacaatg aagcctcctg
    241 cggacgcttt gttccccgcg ctgttctcat ggatcttgag cctgggacaa tggacagtgt
    301 ccggaccgga ccctatgggc agatcttccg ccctgacaac tttgtgtttg ggcaatctgg
    361 tgctggtaac aattgggcta agggccacta caccgagggt gctgagctca ttgactctgt
    421 tctggatgtt gtgaggaagg aagctgagaa ctgtgactgc ttgcaaggat tccaagtatg
    481 ccactccctt ggtggtggta ctggatctgg tatgggtacg ctgttgatct caaagatcag
    541 ggaagagtac cctgaccgca tgatgcttac attctcagtt ttcccctcac cgaaagtatc
    601 tgataccgtg
    gttgagccat acaatgccac tctttctgtc caccagttgg tcgagaatgc
    661 tgatgagtgc atggttctcg ataacgaagc cctctatgac atctgcttca ggactcttaa
    721 gctgaccacc cctagctttg gtgatctgaa ccatttgatc tctgcaacca tgagtggagt
    781 cacctgctgc ctaaggttcc ctggtcagct gaactccgac ctcaggaagc tggcagtgaa
    841 cctgatcccc ttcccccgtc tccacttctt catggtcggc ttcgcgccgc tgacgtcccg
    901 tggctcccag cagtaccggg ccctcacagt ccccgagctc acgcagcaga tgtgggatgc
    961 caagaacatg atgtgtgccg ctgaccctcg ccatgggcgt tacctcaccg cctcggccat
    1021 gttccgcggg aagatgagca ccaaggaggt tgacgagcag atgatcaacg tccagaacaa
    1081 gaactcgtcc tacttcgtgg

    merci, je vais essayer de faire ça!

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  10. #7
    Flyingbike

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    avec ma méthode j'ai trouvé une réponse qui est tout a fait dans la norme de ce qu'on fait en labo couramment.

    J'attends la tienne

  11. #8
    helo62

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    1 ttttaagtta ctgtgtgctt gttgcaggat ctgtaactaa ttcctatgcg attctcttgt
    61 ttgtagggcg aagatgaggg agatcctgca catccaggga gggcaatgtg gcaaccagat
    121 tggcgccaag ttctgggagg tggtgtgcga tgaacatggc attgacccta ccgggcggta
    181 cactggcaat tccgaccttc agttggagcg tgttaatgtc tactacaatg aagcctcctg
    241 cggacgcttt gttccccgcg ctgttctcat ggatcttgag cctgggacaa tggacagtgt
    301 ccggaccgga ccctatgggc agatcttccg ccctgacaac tttgtgtttg ggcaatctgg
    361 tgctggtaac aattgggcta agggccacta caccgagggt gctgagctca ttgactctgt
    421 tctggatgtt gtgaggaagg aagctgagaa ctgtgactgc ttgcaaggat tccaagtatg
    481 ccactccctt ggtggtggta ctggatctgg tatgggtacg ctgttgatct caaagatcag
    541 ggaagagtac cctgaccgca tgatgcttac attctcagtt ttcccctcac cgaaagtatc
    601 tgataccgtg gttgagccat acaatgccac tctttctgtc caccagttgg tcgagaatgc
    661 tgatgagtgc atggttctcg ataacgaagc cctctatgac atctgcttca ggactcttaa
    721 gctgaccacc cctagctttg gtgatctgaa ccatttgatc tctgcaacca tgagtggagt
    781 cacctgctgc ctaaggttcc ctggtcagct gaactccgac ctcaggaagc tggcagtgaa
    841 cctgatcccc ttcccccgtc tccacttctt catggtcggc ttcgcgccgc tgacgtcccg
    901 tggctcccag cagtaccggg ccctcacagt ccccgagctc acgcagcaga tgtgggatgc
    961 caagaacatg atgtgtgccg ctgaccctcg ccatgggcgt tacctcaccg cctcggccat
    1021 gttccgcggg aagatgagca ccaaggaggt tgacgagcag atgatcaacg tccagaacaa
    1081 gaactcgtcc tacttcgtgg


    Merci! je vais essayer
    pour les amorces, j'ai pris celles en rouge:

    RWD: 5' aga.....gga 3'

    REV: 5' gcatt....ggtg 3'

    jai une Tm de 62 degrés

    Ensuite, à partir de la 1ère amorce jusqu'à la fin de la séquence qui va être transcrite, jai 2001-81 bases. Est ce que c'est à partir de ce nb de bases que je px faire le ccalcul?
    J'aurai MM= (2001-81 ) x 660 = 1267200 g/mol
    et donc pour 10 ng, 10x10^-9 / 1267200 = 7,9 x 10^-15 mol

    et après je ne vois pas comment passer de là au nb de cycles...

  12. #9
    Flyingbike

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    je comprends pas tout ce que tu fais

    Pour les amorces, elles ont l'air correctes.

    Je penses que tu vas chercher trop compliqué :

    tu as 10ng de morceaux qui font 1 milliard de pb
    ta matrice fait 480 pb

    tu as donc 480 * 10 / 1 milliard = 4,8 . 10^-6 ng de ta séquence de départ.

    Ensuite, j'imagine que tu sais qu'a chaque cycle de PCR, la quantité d'ADN cible double...

  13. #10
    helo62

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    d'accord, alors j 'ai 4,8 x 10^-6 ng au départ, et j'en veux 10^3/4,8x10^-6 = 208 333 333 fois plus.
    donc 2^x = 208 333 333
    j'obtiens 27 cycles, tu trouves pareil?

  14. #11
    Flyingbike

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    je crois que tu as oublié un 3

  15. #12
    helo62

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    208 333 333, 3 tu vx dire?

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  17. #13
    Flyingbike

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    non, 2 083 333 333

  18. #14
    helo62

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    c'est mon calcul de départ qui est faux alors, parce-que 10^3/4,8x10^-6 ça fait bien 208 333 333
    je comprend pas ^^

  19. #15
    helo62

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    Sinon, pour le protocole d'amplification, je fais :
    - température pour l'hybridation : < 62 ° ( par ex 40)
    - temp allongement : 50
    - temp dissociation matrice/amorce : > 62 ° ( par ex 70)

    Pour la durée des différentes étapes, il suffit d'indiquer celle de l'allongement? Et dans ce cas, vu que la vitesse de la polymérase est de 1kb/min, est ce que je considère juste la longeur de la seq en gras ( 420 bases, dans ce cas la durée sera de 4,2 min) ou il faut rajouter le nb de pb de l'amorce FWD par ex, et le nb de pb de la séquence non en gras ( bases 611 à 2001 )?

  20. #16
    Flyingbike

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    tu as raison c'est moi qui déconne
    sinon pour la t° d'hybridation, non pas 40 parce que la tes amorces vont se coller n'importe ou.
    Tu peux faire 58-60, et encore ça dépend de la composition du tampon.

    Ton amplicon fait grossièrement 500, tu peux faire entre 30 et 40 secondes.

    (1 min par kb ça fait pas 4,2 min pour 420 bases !)

    Pour la température de dénaturation, on fait 95° dans 99% des cas.

    La durée des différentes étapes ben ça dépend aussi des conditions. ça dépend du type de matrice, si c'est de l'ADN génomique tu peux faire genre 30 secondes de chaque.

  21. #17
    helo62

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    ok super merci bcp pour ton aide !!
    Juste une dernière question, dans un autre exo :
    On a la séquence du gène X qui a pu être déterminé à partir de son ADNc ( et ce gène code pour une protéine de 733 ac aminés):

    GGGGTGA...............AMORCE(F WD)...GAATATG (...2196 ... )TAA.....(amorce REV).............CGGT

    On se propose d'amplifier la quasi totalité de la seq codante comprise entre l'ATG et le TAA par PCR

    Dans la 1ère question on a déterminé les amorces pour la PCR (ça jai réussi)
    Ensuite il faut determiner la taille exacte en pb du fragment obtenu. Pour ça, je prend juste le nb de nucléotides entre ATG et TAA (2196 + 6), ou il faut considérer les 733 ac aminés codés par le gène?

  22. #18
    Lighta_marame

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    Bnjr j'ai lu votre conversation et j'ai beau essayé de comprendre comment vous avez fait pour le calcule de nombre des cycles mais je ne suis pas arrivée...
    vous pouvez me réexpliquer d'une autre maniére s.v.p^^

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  24. #19
    Loupsio

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    pour ca il te faut te rappeler tes cours de math de Lycée
    en l'occurence si tu doubles ton ADN a chaque cycle, au bout de trois cycles tu as
    1*2*2*2=8 brins
    que l'on peut représenter par 2³ pour aller plus vite,
    il faut donc te souvenir de la fonction inverse à la fonction 2^

    il s'agit de la fonction log2
    log2(8)=3 on retrouve bien les 3 cycles a partir du nombre final de brins d'ADN.

  25. #20
    Lighta_marame

    Re : PCR - Calcul du nombre de cycles

    Ouiii hh c bon là je viend de comprendre..
    merci infiniment ^^

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