clonage fou!

[invitefd364bf5]

Bonsoir à tous!

Un clonage a priori classique me donne du fil à retordre et peut-être avez-vous déjà eu des soucis avec l'enzyme de restriction SalI?
En gros, j'ai inséré un gène dans un vecteur grâce à l'enzyme SalI, et malgré les clones qui sortent positifs par criblage PCR, il m'est impossible de ressortir mon insert.

Est-ce que c'est possible qu'une ligation ait lieu malgré un bout cohésif abimé?
Est-ce que le site en 5' de mon insert peut-être abimé et pas celui en 3'?
Sachant que j'ai fait ce clonage à l'identique pour un autre insert et que j'ai le même problème, est-ce que c'est statistiquement possible que le même site de restriction "saute" deux fois?

Je ne comprends vraiment pas là, alors si vous avez des suggestions, je suis preneuse.

Pour info, je suis sûre et quasi certaine que mes clones ont bien intégré un vecteur recombinant. J'ai fait ma PCR de criblage avec un primer sur l'insert et un primer
sur mon vecteur.

Merci beaucoup
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[piwi]

SalI est bloquée par les méthylations CpG. Si le site de restriction subit cette transformation pour une obscure raison, alors il sera effectivement impossible de faire ressortir l'insert avec cette enzyme.

piwi

[invitefd364bf5]

Bonjour et merci Piwi pour ta réponse.

J'ai bien vu qu'il y avait une histoire de methylation CpG avec cette enzyme mais je ne sais pas ce que c'est :s
D'autres part, est-ce que ce "léger problème" peut avoir lieu sur un seul des deux sites m'ayant servi à cloner? Parce que quand j'essaie de sortir mon insert, je vois bien que mon plasmide est comme linéarisé, comme si l'enzyme avait coupé une fois mais pas deux.
Merci encore en tout cas et je me rencarde sur cette histoire de methylation CpG...
bonne journée

[piwi]

Oui c'est possible qu'un seul des deux sites soit méthylé.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitefd364bf5]

Bonjour,

Bon et bien avant de me relancer dans des commandes de nouveaux primers, de nouveaux clonages etc ... j'ai choisi quelques clones qui sortaient positifs en PCR, fais des "easy preps " et digéré par SalI. J'en ai 1 sur 14 qui semble bon.... C'est pas gagné, mais comme on me dit souvent :" un seul suffit!"
Merci encore piwi

[piwi]

Oui.

Je rappelais justement à l'instant à une collègue (et amie) que j'avais eu un clonage difficile une fois où il m'avait fallut screener 500 colonies pour trouver le bon clone. Une fois que je l'ai eu j'ai pu avancer vitesse grand V sur ce projet. Un seul suffit ^_^